DNA Replication and Repair_Lei Shi1、DNA损伤修复的类型、来源。

⑴细胞内源性的损伤—复制错误,碱基脱氨氧化；⑵外源型-环境因素造成的损伤—辐射（TT）致癌物质（烷化剂、EB亚硝酸等）如碱基的损伤、错配,碱基的缺失,碱基的交联等.2、男性谱系和女性谱系鉴定的机理。

⑴男性谱系：Y染色体，Y-STR（short tandem repeat）是Y染色体上的短串联重复序列。

Y-STR经常用于法医学，亲子鉴定和家谱DNA测试。

Y-STR特异性地从雄性Y染色体获得。

Y染色体上的基因只能由亲代中的雄性传递给子代中的雄性（即由父亲传递给儿子），因此在Y染色体上留下了基因的族谱，Y-DNA 分析现在已应用于家族历史的研究。

⑵女性谱系：线粒体DNA。

线粒体DNA（mtDNA）是DNA的一部分，是母系遗传的，通过卵子传递，且一般很难发生改变。

mtDNA存在于双膜细胞器内。

每个细胞中有许多线粒体DNA拷贝。

•如果样本有限，mtDNA可以获得更多的DNA,•可以从高度降解的来源获得DNA3、基因操作的载体必须具备的特征是什么？常用的载体有哪些？⑴克隆载体应具备的主要特点：至少有一个复制起点（origin of replication, ori）至少有一个选择性标志（selection marker）有适宜的限制性内切酶的单一切点：称为多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）应有较高的拷贝数。

⑵表达载体：原核表达载体：除了具备克隆载体的一般特点外，还需有调控外源基因有效转录和翻译的序列，如启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等。

⑶真核表达载体包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。

真核表达载体中还具有：①真核表达调控元件：包括启动子、增强子、转录终止序列、poly A 加尾信号等②真核细胞复制起始序列③真核细胞药物抗性基因目前应用最广泛的原核表达载体是大肠杆菌表达载体。

常用载体：质粒载体：pBR322质粒噬菌体载体：λ噬菌体、M13噬菌体病毒载体：反转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等4、如何分离蛋白质（分离方法及步骤）蛋白质分离主要根据五种原理：分子大小、溶解度、电荷、吸附性质、对配体分子的生物学亲和力等。

分离方法有透析与超滤、凝胶过滤法、离子交换层析法、低温有机溶剂沉淀法等。

5、蛋白质鉴定的常用方法（质谱鉴定）用来分析蛋白质或多肽的质谱有两个主要部分，1）样品入机的离子源，2）测量被介入离子的分子量的装置。

首先是基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）为一脉冲式的离子化技术。

它从固相标本中产生离子，并在飞行管中测其分子量。

其次是电喷雾质谱（ESI-MS），是一连续离子化的方法，从液相中产生离子，联合四极质谱或在飞行时间检测器中测其分子量。

在MALDI-TOF中，最重要的进步是离子反射器和延迟提取，可达相当精确的分子量。

在ESI-MS中，纳米级电雾源的出现使得微升级的样品在30～40 min内分析成为可能。

目前多为酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用鉴定蛋白质。

下面以肽质指纹术和肽片段的测序来说明怎样通过质谱来鉴定蛋白质。

(1)肽质指纹术（peptide mass fingerprint， PMF）用酶（最常用的是胰酶）对由2-DE分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂，断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量（MALDI-TOF-MS，或为ESI-MS），这一技术能够完成的肽质量可精确到0.1个分子量单位。

所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比（理论肽是由实验所用的酶来“断裂”蛋白所产生的）。

配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜，“冠军”肽片段可能代表一个未知蛋白。

若冠亚军之间的肽片段存在较大差异，且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好，则说明正确鉴定的可能性较大。

(2)肽片段（peptide fragment）的部分测序肽质指纹术对其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白质。

为进一步鉴定蛋白质，出现了一系列的质谱方法用来描述肽片段。

用酶或化学方法从N-或C-末端按顺序除去氨基酸，形成梯形肽片段（ladder peptide）。

首先以一种可控制的化学模式从N-末端降解，可产生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定数目的肽质量由MALDI-TOF-MS测量。

另一种方法涉及羧基肽酶的应用，从C-末端除去不同数目的氨基酸形成肽片段。

化学法和酶法可产生相对较长的序列，其分子量精确至以区别赖氨酸（128。

09）和谷氨酰胺（128。

06）。

或者，在质谱仪内应用源后衰变（post-source decay，PSD）和碰撞诱导解离（collision-induced dissociation， CID），目的是产生包含有仅异于一个氨基酸残基质量的一系列肽峰的质谱。

因此，允许推断肽片段序列。

肽片段PSD的分析在MALDI 反应器上能产生部分序列信息。

首先进行肽质指纹鉴定。

之后，一个有意义的肽片段在质谱仪被选作“母离子”，在飞行至离子反应器的过程中降解为“子离子”。

在反应器中，用逐渐降低的电压可测量至检测器的不同大小的片段。

但经常产生不完全的片段。

现在用肽片段来测序的方法始于70年代末的CID，可以一个三联四极质谱ESI-MS或MALDI-TOF-MS联合碰撞器内来完成。

在ESI-MS 中，由电雾源产生的肽离子在质谱仪的第一个四极质谱中测量，有意义的肽片段被送至第二个四极质谱中，惰性气体轰击使其成为碎片，所得产物在第三个四极质谱中测量。

与MALDI-PSD相比，CID 稳定、强健、普遍，肽离子片段基本沿着酰胺键的主架被轰击产生梯形序列。

连续的片段间差异决定此序列在那一点的氨基酸的质量。

由此，序列可被推测。

由CID图谱还可获得的几个序列的残基，叫做“肽序列标签”。

这样，联合肽片段母离子的分子量和肽片段距N- C端的距离将足以鉴定一个蛋白质。

它的基本原理是蛋白质经过蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物，在质谱仪中肽段混合物电离形成带电离子，质谱分析器的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（即质荷比，M/Z）的肽段离子分离开来，经过检测器收集分离的离子，确定每个离子的M/Z值。

经过质量分析器可分析出每个肽段的M/Z，得到蛋白质所有肽段的M/Z图谱，即蛋白质的一级质谱峰图。

离子选择装置自动选取强度较大肽段离子进行二级质谱分析，输出选取肽段的二级质谱峰图，通过和理论上蛋白质经过胰蛋白酶消化后产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图进行比对而鉴定蛋白质。

一开始，蛋白质谱通过离子化（Electrospray Ionization，ESI）或者基质辅助激光解吸电离（Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI）的方法对完整的蛋白质进行离子化后进入质谱分析仪器，这也被称为“top-down”蛋白分析方法。

后来，完整的蛋白质通过酶切作用后，分解成多肽混合物，这些混合物进入质谱仪后，通过多肽指纹图谱或串联质谱的方法进行鉴定，这被称为"bottom-up"方法。

显然，后者可以从多肽水平实现对蛋白质的分析和鉴定。

思考题wnagyujie1.核酸分子杂交技术答：基本原理是利用核酸分子的碱基互补原则发展而来，是定性或定量检测特异性RNA或DNA序列片段的有力工具。

在碱性环境中加热或者加入变性剂等条件下，双链DNA之间氢键被破坏（变性），双链解成两条单链，此时加入异源DNA或RNA（单链）并在一定离子强度和温度下保温（复性），若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。

进行分子杂交实验时，用一种预先分离纯化的已知DNA或RNA序列片段去检测未知的核酸样品，作为检测工具的已知DNA或RNA序列片段为杂交探针（probe），常用放射性核素标记。

根据探针来源和性质，分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡核苷酸探针。

相关技术：Southern 杂交、Northern 杂交、原位杂交（ISH）、荧光原位杂交（FISH）等。

每一种杂交技术都有其特点，因探针的选择不同又可以衍生出许多相关的技术，在不同领域发挥着重要作用。

特点:1.灵敏度高、特异性强；2.用于 DNA和RNA的定性、定量检测。

用途:1.检测特异 DNA序列的拷贝数、特定DNA区域的限制性内切酶图谱，判定基因的缺失、插入、重排现象;2.特异基因克隆的筛选；3.核酸序列的初步分析；4.PCR技术的分子基础。

2.肿瘤发生发展分子机制？3.DNA指纹技术的基本原理、特点、主要应用？答：基本原理：人体基因组DNA中驻存着可供正常生存和遗传的信息，DNA序列存在三种类型：单拷贝序列、中等程度重复序列、高度重复序列。

重复序列约占DNA总序列的3%-4%。

每个重复在300个核苷酸长度之内，由于高度重复序列经超离心后，以卫星带出现在主要DNA带的邻近处，所以也称为“卫星DNA”，卫星DNA中的重复序列单元称之为“小卫星DNA”，其具有高度可变性，有个体差异。

但小卫星DNA有一小段序列在所有个体中都一样，称为“核心序列”。

把核心序列串联起来作为分子探针，与不同个体进行分子杂交，就会呈现各自特有的杂交图谱，和人的指纹一样，具有专一性和特征性，因此作为DNA指纹。

特点：1.高度特异性；2.稳定的遗传性3.体细胞稳定性主要应用于法医和亲子鉴定，比如1.产前亲子鉴定，主要针对遭遇性侵怀孕的妇女，目的是确定其所孕胎儿与性侵事实的关联性，以及为当事人是否终止妊娠提供科学依据。

2.无名尸骸的身份确认3.亲权认定标准。

4.蛋白质组学怎么产生的？背景？研究内容？结合自己的研究现状方向，解释蛋白组学研究进展与应用？答: 蛋白质组学（英语：proteomics），是对蛋白质特别是其结构和功能的大规模研究，是在90年代的变化是导致生命功能失常的直接因素，只有在基因组上的研究不能回答诸如某基因表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰以及他们的亚细胞分布情况等问题，基于以上原因，蛋白质组学应用而生。

蛋白质组学是从整体水平研究细胞、组织或有机体蛋白质组的一门新兴学科。

其利用生化方法对所有蛋白质进行大规模研究，包括对基因产物的功能分析，如蛋白质的大规模鉴定、定量、定位、功能。

结构、修饰、调节和活性的研究，也包括利用酵母双杂交系统研究蛋白质的相互作用，而对单个基因或mRNA的研究不属于蛋白质组学范畴。

研究内容：目前主要包括两大类，其一表达蛋白质组学，观察某个细胞或组织中蛋白质表达的整体变化，即研究机体在生长发育、疾病与死亡的不同阶段中，细胞与组织的蛋白表达谱的变化；其二细胞图谱蛋白质组学，主要通过分离蛋白质复合物系统的研究蛋白质间的相互作用，以建立细胞内信号通路的复杂网络图。