B. 饱和溶液法
用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可 防止局部过浓，但加量较多时，样品会被稀释。
C. 透析法
先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入大体积饱和硫 酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度 后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连 续性，盐析效果好，但程序繁琐，故用于要求较精确、 样品体积小的试验中使用（如结晶）。
化学因素：有强酸、强碱、尿素、重金属盐、SDS等。
蛋白质表面特性－沉淀屏障
蛋白质分子周围的水化层
水溶液中蛋白质可视为胶粒，其周围存在着稳 定的水化层， 胶粒外的这部分水客观上起排斥 作用，称为“水化层斥力”
分子间的静电排斥作用
蛋白质表面特性 ——沉淀策略及方法
策略
破坏蛋白质四周水化层 降低双电层厚度
eGFP的最佳盐析范围是45%- 60%
分级沉淀2 （根据分级沉淀1 的结果，确定浓度范围）
0～ 25%饱和度盐溶液，杂质盐析（沉淀），有效成分盐溶。 离心，得上清（含有效成分）。
上清中25%～ 60%饱和度盐溶液，有效成分盐析， 另一部分杂质盐溶。
二、制备蛋白质
蛋白质表面特性－蛋白质组成
蛋白质组成
20 种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水性 氨基酸和亲水性氨基酸
蛋白质折叠趋势
疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势 亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势
结果
在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基 暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区
蛋白质表面特性－蛋白质性质
1. 盐分级沉淀
固体硫酸铵加入量
1 L 溶液中硫酸铵的百分饱和度由 S1 增大到 S2 所需要加入的固体硫酸铵质量g 为
g

533S2 S1
100 0.3S2
（20℃）
g 541S2 S1 （25℃）
100 0.3S2
也可使用“表 2-1 调整硫酸铵溶液饱和度的计 算表（P22）”
增强绿色荧光蛋白eGFP的硫酸铵盐析曲线（沉淀）
2. 盐析曲线制作
1
protein relative content in supernatant )
0.8
0.6
0.4
0.2
0 0
20
40
60
80
100
％ of saturation of ammonium sulphate
硫酸铵盐析时上清中的蛋白含量 ● eGFP含量 ； ■ 总蛋白含量。
溶解度大——可配制成具有较高离子强度的 无机盐溶液
溶解度受温度的影响较小 盐溶液密度不高，以便蛋白质沉淀的沉降或
离心分离。
1. 盐分级沉淀
盐的选择 通常采用中性盐，最常用硫酸铵，原因： 水中溶解度大，分级效果好，不易引起蛋 白质变性，廉价易得，分段效果好。
硫酸铵：
20℃下，饱和浓度为4.1 mol / L（相当于533 g/L） 0℃下，饱和浓度为3.9 mol / L（相当于505 g/L）
纯化方法
分离纯化：除去各种杂质，获得较高纯 度物质的过程。
蛋白质和酶分离提纯方法：沉淀分离、 层析分离、电泳分离、超离心分离等。
第二章 沉淀法
盐析沉淀 有机溶剂沉淀 选择性沉淀
第一节 基本原理与沉淀类型
一、基本原理
沉淀分离：通过改变某些条件或加入某种物 质，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而 从溶液中沉淀析出的技术。
盐析沉淀-盐析的定义
定义
蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、 发生沉淀的现象称为盐析。
低离子强度下的盐溶
向蛋白质的纯水溶液中加入电介质后，蛋白质将吸附盐离子， 而形成扩散双电层（产生分子间相互排斥作用）导致蛋白质 的溶解度增大，发生盐溶。
高离子强度下的盐析
由于盐的水化作用，其将争夺蛋白质水化层中的水分子，使 蛋白质表面疏水区脱水而暴露，增大它们之间的疏水性作用。
1. 盐分级沉淀
液体（饱和度100%）硫酸铵加入量
硫酸铵的百分饱和度由 S1 增大到 S2 所需要加 入的硫酸铵溶液体积V 为
V V 0 S 2 S1 （20℃） S3 S2
V0，原来溶剂的体积（ml）； S3，100（一般用100%饱和度的液体硫酸铵）
2. 盐析曲线制作
分级沉淀
将每步离心获得的沉淀重新溶解，测定其中 总蛋白和目标蛋白的浓度。
以硫酸铵的饱和度为横坐标、沉淀中总蛋 白和（或）目标蛋白浓度为纵坐标，得到 蛋白质盐析曲线。
分级沉淀1 （每步测定沉淀中总蛋白及有效成分含量）
relative content of eGFP in precipitate '
2. 盐析曲线制作 0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0 0 10 20 30 35 40 50 60 65 70 80 saturation of ammonium sulphate, %
盐析的机理
①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶 解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度， 破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下 降；
②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；
③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水 分子的极化，使水活度降低。
1. 盐分级沉淀 1）盐的选择
沉淀方法
改变溶液 pH 值 加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机术
盐析沉淀 有机溶剂沉淀 选择性沉淀
（一）盐析法
盐析沉淀-学习要点 识记：盐析和盐溶概念 理解：盐析沉淀的原理，影响盐析的各种因素 应用：掌握盐析操作过程
1. 盐分级沉淀
2）硫酸铵盐析（加硫酸铵至一定饱和度）
分级沉淀1 （每步测定有效成分含量和总蛋白含量）
1. 盐分级沉淀
硫酸铵的加入有以下几种方法： A. 固体法
用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上 常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并 充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；
蛋白质的胶体性质
蛋白质的分子量约6～1000 kDa，分子直径约为1～30 nm。 在此粒径范围内，蛋白质可视为胶体，并表现出胶体溶液 的部分性质
蛋白质的两性电离和等电点
蛋白质两端及侧链中有一些解离基 ，解离程度受pH影响。
蛋白质的变性
物理因素：加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、 超声波的作用等；