（上海农科院产品），混匀，置于65℃的水浴中10分钟（中间摇
动一次）。

(5)离心。从水浴中取出离心管，依加入苯酚和氯
仿各350ul（酚和氯仿的体积与抽提液的体积大约相
等）,充分混匀5分钟，在12000rpm/min下离心5分钟。

(6)将上清液转移到1.5ml 离心管中，加入2ulRNA酶
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
B.饱和溶液法 这是一种使蛋白质脱水沉淀比较温
和的力法。其操作是在蛋白质溶液中逐步加人预先调好pH的 饱和硫酸铵溶液，不同饱和硫酸铵溶液，不同饱和度所需的 硫酸铵的量可用下列公式表示：
V＝V0
S2－S1 S3－S2
V表示需要加入硫酸铵溶液的体积(ml)； V0表示原来溶剂的体积(m1)； S1和S2含义同上； S3表示需要加入硫酸铵溶液的饱和度(一般用百分之百)。
子排列有规则，后者分子排列无规则

在提纯阶段，当某一蛋白质浓度达到5%- 30%水平时，只要 条件合适，就能产生一定形状的晶体。

三、制备核酸
1．DNP／RNP复合物的解聚
(1)去污剂 十二烷基硫酸钠(SDS) 十二烷基肌氨酸钠[CH3(CH2)10CON(CH3)CH2COO-Na+]、 脱氧胆酸钠(DOC)、 聚氧乙基十六烷基酚醚(Triton x一100)
第二章 沉淀法
第一节 第二节 基本原理与沉淀类型 应用实例
第一节
基本原理与沉淀类型
一、基本原理 二、制备蛋白质 三、制备核酸
一、基本原理
根据各种物质结构不同，改变溶质的性质，致使 抽提液有效成分溶解度变化。
沉淀（precipitation）：在溶液中加入沉淀剂使溶质的溶解 度降低，形成固相从溶液中析出，从而达到分离的一种技术。
②盐析：[盐]高时，S（蛋白质的溶解度）随[盐]增加而
降低；
1. 盐析法
(1) (2) 盐分级沉淀 盐析曲线制作
(3)
(4)
盐析的影响因子
脱盐
(1)盐分级沉淀
①盐的选择：常选用硫酸铵,其优点：
a.溶解度大，对温度不敏感.(水的温度=25℃，硫酸铵的饱和溶解度=769g,当水的 温度=0℃时，其饱和溶解度高=679g,这是其他盐类所不具备的。)
蛋白质浓度以及聚合物分子质量的影响。
5．选择性沉淀法
选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯。 ⑴ 热变性：利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高
温度使非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。
⑵ 表面活性剂和有机溶剂变性：使对表面活性剂和有机溶 剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀。通常在冰浴或冷室中进行。 ⑶ 选择性酸碱变性：利用对 pH值的稳定性不同而使杂蛋 白变性沉淀。在分离纯化流程中常附带分离纯化的步骤。
(2)凝集素：为一种特殊的蛋白质，对糖蛋白中糖链的末端序 列具有明显、特异的凝集力。如伴刀豆球蛋白与含有葡萄糖、 甘露糖等分子的糖蛋白能发生特异的凝集沉淀作用，通过离心 操作可把糖蛋白和一般蛋白质分开，再用单糖作抑制剂就能使
其解离。该沉淀法反应条件较温和，专一性强。
(3)重金属：重金属盐(如铅盐、汞盐)作为蛋白质沉淀剂，也 能将蛋白质或酶得到纯化。由于重金属会使蛋白质变性，因此 应用时要控制在较温和的条件下进行，并要及时通过透析方法
（2）盐析曲线的制作
如果要分离一种新的蛋白质和酶，则应先确定沉淀该 物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下：
蛋 白 质 量 或 酶 活 力
(mg)
10
20 30
40
50
60
70
80
90 100
硫铵饱和度％
（3）影响盐析的因素

①盐的种类：影响KS，KS越大，效果越好


② 溶质的起始浓度
③ 盐析剂用量
DNA的提取实例
水稻叶片中提取DNA


(1)称取-剪碎。称取约0.1g叶片，剪碎后放在2ml离心管中。

(2)液氮提取。置离心管于液氮中，用竹签将叶片捣碎。
(3)进一步粉碎。每个离心管中加三粒钢珠（使用之前最好在液氮 里浸一下），而后置振荡器上高速振荡3次，每次20秒（将叶片进 一步粉碎）。 (4)抽提。取出离心管中的钢珠，加600～700ul的抽提液BufferA
b.分级效果好.有些抽提液经过加适量硫酸铵的一步分级沉淀处理后，就可除去杂
蛋白75％以上；
c.有稳定蛋白质结构的作用.将2-3 mol／L硫酸铵盐析的蛋白质置低温下保存一年，
其性质没有变化；
d.价格低廉，废液可以肥田。 但是用硫酸铵或其他盐类进行分级沉淀都有一个共同的缺点，即得到 的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。
此法比加入固体硫酸铵沉淀法温和，但是对 于大体积样品不适用。因为硫酸铵溶液的大量加 入，将导致样品溶液体积增加。例如，当样品达 到50％硫酸铵饱和度时，其体积增加一倍。
C.透析法：透析袋放入一定浓度的大体积溶液中， 通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度， 沉淀蛋白质。
此法仅在要求较精确、样品体积小的试验使用。
案例
如从酵母菌细胞中纯化醇脱氢酶时采用了改变温度的选 择性沉淀法，即酵母于粉中加0.066mol／L磷酸氢二钠溶液， 37℃水浴保温2h，室温搅拌3h，离心收集上清液，升温至 55℃，保持20min后迅速冷却，离心去除热变性蛋白，上清液 即为热稳定的醇脱氢酶溶液。
6．结晶沉淀法

蛋白质沉淀可分为晶体沉淀和无定形沉淀两类，前者分
完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分 离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。各种饱和度下需加固体硫 酸铵的量。 （1）计算法 X=G（p2-p1）/1-Ap2 G为经验常数，0℃ 515，20 ℃ 513 A为常数 0 ℃ 0.27 20 ℃ 0.29 P2、P1为初始和最终溶液的饱和度 X为1L溶液所需加入的硫酸铵的克数 （2）查表法
(8)将离心管中的洒精倒出，自然晾干(约15分钟)，然后加入 60ul的TE，混匀后放在－20℃的冰箱内保存，待用。

TE:三羟甲基氨基甲烷-HCl 加EDTA配置而成的 PH在8
总
1. 2. 3. 4.

结
随堂练习

P35课后习题2、3
沉淀法也称溶解度法。其基本原理是：根据各种物 质的结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团与亲水基
团之间比例的差异）来改变溶液的某些性质(如pH、极
性、离子强度、金属离子等)，就能使抽提液中的有效 成分的溶解度发生变化。
二、制备蛋白质
1. 盐析法 2. 有机溶剂沉淀法
3. 蛋白质沉淀法
4. 聚乙二醇沉淀法
常用有机溶剂：乙醇、甲醇、丙酮等。
优点： ①分辨能力比盐析法高，一种溶质只在一个比较窄的有机溶 剂范围内沉淀； ②沉淀不需脱盐； ③有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，容易进行固液分离； ④有机溶剂容易蒸发，不会在成品中残留，适用于食品、药 品的制备。
缺点：容易引起蛋白质变性失活，并且有机溶剂易燃、易爆， 对安全要求较高。

注意事项 (1)低温下操作 防止有机溶剂的放热使蛋白变性
(2)中性盐作用
增加蛋白质溶解度，防变性
结合蛋白质，致其溶解度降低
(3)多价阳离子作用
3．蛋白质沉淀法
蛋白质沉淀法所用的试剂则仅对一类或一种蛋白质沉淀起 作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。 (1)碱性蛋白质：如鱼精蛋白，除能有效地沉淀核酸物质外， 还能沉淀某些蛋白质。当把鱼精蛋白加入部分纯化的酵母磷 酸果糖激酶溶液时，溶液中的酶蛋白便吸附到鱼精蛋白核酸 沉淀物上。沉淀物用磷酸缓冲液洗脱后，收得的磷酸果糖激 酶的纯度比原来提高了9倍。
把蛋白质与重金属尽快分开。
4．聚乙二醇沉淀法
“聚乙二醇” ) ， 简写为 PEG ，HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4）
本方法的优点是：
①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。 ②沉淀效能高，少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子。 ③沉淀后有机聚合物容易去除。 因此应用范围颇广。但是，它也受各种因子如pH、离子强度、
(2)DNA与RNA的分离 ①盐析法：在提取DNA时，RNA属杂质；反之，DNA
是杂质。根据它们在不同浓度的盐中溶解度不同达到 分离的目的。 ②酶水解法：提取DNA时，可用RNase水解RNA杂质； 在提取RNA时，可用DNase水解DNA杂质。 注意点
3．核酸沉淀

在核酸溶液中加入某些有机溶剂和非离子型聚 合物等试剂时，核酸会被有效地沉淀出来。

(1)有机溶剂 ①乙醇-盐溶液：核酸的钠盐或钾盐在多数有 机溶剂(如乙醇、异丙醇)中是不溶解的。
②异丙醇
在含DNA(或大分子rRNA)的溶液中，加入0.3mol／L NaAC 和0.54～1倍体积的异丙醇，放置短时间后，经离心即可得 到核酸沉淀物质，而多糖及小分子RNA则分布于上清液中。 缺点：但异丙醇沸点高，从核酸中不易除去，蔗糖、 NaCl等 在低温下易和DNA产生共沉淀。
④温度和pH：影响β值而影响S。尤其是影响相对溶解度
⑤杂质
(4)脱盐：凝胶过滤法和透析法
透析法注意事项
①透析带处理：用蒸馏水洗净，检查无漏洞
②透析液选择：一般为低离子强度中性缓冲液
③掌握透析时间：搅拌，样品液与透析液体积 比为1：10，3h.
2 .有机溶剂沉淀法 ⑴基本原理
①降低水溶液的介电常数。向溶液中加入有机溶剂能降低溶 液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白 质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 ②由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从 蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子 的水膜，因而发生沉淀作用。
5. 选择性沉淀法
6. 结晶沉淀法