• 利用低浓度的IPTG诱导可提高可溶蛋白 的含量。
(4)蛋白质的包涵体形式表达与蛋白质 复性
• 包涵体是指在某些生长条件下，大肠杆菌能
积累某些特殊的生物大分子(主要是蛋白质组 成)，它们在细胞内致密地聚集成没有生物活
性的直径约0.1-3.0μm的固体颗粒，或被膜
包裹或形成无膜裸露结构。 • 包涵体主要由蛋白质组成，其中大部分是克 隆外源基因的表达产物。
（3）供给丰富的培养基，创造最佳条件，如供
氧、pH。
包涵体蛋白的分离、纯化
• 包涵体的形成不仅可获得高表达、高纯度的重组蛋
白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白质的破坏。
• 由于包涵体是蛋白质聚集而成的致密颗粒，分离的第一 步是对培养收集的细胞进行 破碎 ，有效的方法是高压
匀浆结合溶菌酶处理，然后5000~20000g离心 ，可使大
抑制子基因及PR启动子、pRC23的PL启
动子及SD序列
优点:
①cIts857抑制子基因与PL启动子同在,以便选用
蛋白酶活低的宿主细胞,使表达产物不易降解; ②SD序列后面紧跟多克隆位点,便于插入带起始 ATG的外源基因,可表达非融合蛋白; ③强的转录终止信号可防止出现“通读”现象, ④质粒小,有利于增加其拷贝数及容量,可以插入 较大片段的外源基因; ⑤PR与PL启动子串联,可以增强启动作用。本系 统为温度诱导,外源基因表达量可达到细胞总 蛋白的20%-30%, 包涵体形式存在, 不易被降 解,均一性好。
即可将包涵体从细胞裂解物中分离出来）
• 减少对宿主菌的毒害
包涵体形成的原因
• 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物 中翻译后修饰所需的酶类，致使中间体大量积累，容 易形成包涵体沉淀。
• 缺乏蛋白质折叠过程中需要的某些酶和辅助因子，
或环境不适，无法形成正确的次级键等，也是原因之 一。
• 表达量越高越容易形成包涵体。可能因为合成速度
以CNBr处理去除融合多肽示意图
凝血因子Xa切割融合蛋白示意图
GST融合表达载体 pGEX6p-3
GST纯化
例
• 上清液加入1mL 50%的 谷胱甘肽-琼脂糖珠 混 悬液中，室温下轻轻混匀超过2min。加50mL冰浴预 冷的PBS液洗涤，混匀， 500g离心10s。用PBS液洗 涤2次，用1～2mL冰冷的PBS重悬琼脂糖珠，并移入 一个1.5mL微量离心管中。 • 室温下500g离心10s收集琼脂糖珠，弃上清液。加
• 表达非融合蛋白的操纵子:
细菌或噬菌体的启动子一细菌的核糖体结合位 点(SD序列)一真核基因的起始密码子一结构基 因一终止密码。 • 要求：SD序列与翻译起始密码ATG之间的距离 要合适 • 特点：非融合蛋白能够较好地保持原来的蛋白 活性；容易被蛋白酶破坏；非融合蛋白N末端 带有甲硫氨酸,可能引起人体免疫反应。
（1）化学裂解
可采用诸如溴化氰（Met↓）、BNPS-3-甲基吲哚 （ Trp↓ ） 、 羟 胺 （ Asn↓Gly ） 等 试 剂 或 低 pH （Asp↓Pro）来进行融合蛋白的化学裂解。
（2）酶解
• 温和；高度专一性。 • 有用的酶有：凝血酶、肠激酶、Xa因子、凝乳酶、胶 原酶等。这些酶都具有较长的底物识别序列（比如在 凝乳酶中为7个氨基酸），从而降低了蛋白质中其他无 关部位发生断裂的可能性。 • 肠激酶和凝血酶应用最多，因为它们切割各自的识别 序列的羧基端，就使带有天然氨基端的被融合部分得 以释放。
融合表达质粒pBG-2的结构
pET系统
• LB培养基或M9培养基中生长良好； • 产物以包涵体形式存在于细胞内 • 外源基因最大表达量可占细胞总蛋白的 50%。中试生产中,可以用乳糖代替IPTG 作为诱导剂, 降低发酵成本； • 新的PET系统带有his标记, 标记与克隆 位点之间有酶切割位点,使产物能方便地 使用金属整合物分离材料进行分离,一步 达到高纯度、高收率。
(1)表达载体需要具备的条件
1、能够独立复制，复制能力强，多用松弛型； 2、具有灵活的多克隆位点； 3、具有方便的筛选标记； 4、具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA 聚合酶识别； 5、具有很强的终止子； 6、mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码 AUG和SD序列； 7、一般具有阻遏子，使启动子受到控制
• 宿主细胞有两类：
原核细胞表达体系（大肠杆菌、枯草芽孢杆
菌、链霉菌）； 真核细胞表达体系（酵母、哺乳动物细胞）
1.原核细胞表达体系
• 大肠杆菌(Eschertchia coli) EPO能否 研究的比较多，技术成熟； 在本体系 进行表达? 操作方便；成本低； 不存在翻译后修饰作用，对蛋白质产物 不能糖基化； • 枯草芽孢杆菌 分泌能力强；具有若干种有
表达载体的基本结构
Ribosome Promoter binding site
Terminator
Gene
DNA RNA transcript
(2)基因工程药物常用的表达载体 • pBV220(3.66kb)系统，
• pET系统
pBV220表达系统
• pBV220系统组成:
pUC8的多克隆位点、核糖体rrnB基 因终止信号、pBR322第4245－3735位、 pUC18第2066－680位、 噬菌体cIts857
实现分泌表达的条件
• 合适的信号肽(碱性磷酸酶信号肽(phoA)、
膜外周质蛋白信号肽(OmpA)、霍乱弧菌 毒素B亚单位(CTXB)等)；
• 培养条件：培养温度影响着分泌的速度，分泌 速度又与蛋白质的正确折叠有关； • 启动子的强度和诱导剂的浓度也有影响； • 目前普遍接受的观点：
低温，低强度的启动子和较低浓度 的诱导剂，可能实现分泌表达。
太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能
正确配对，过多的蛋白间可能存在非特异性结合，蛋 白质无法达到足够的溶解度等。
减少包涵体形成的策略
（1）降低重组菌的生长温度。
（2）促进重组蛋白质可溶性表达的生长 添加剂： 高浓度的多醇类、蔗糖可以阻止分泌到周质的 蛋白质的聚集反应。其它添加剂还有乙醇（诱 导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二 硫化合物（改变细胞周质的还原态，影响二硫 键的形成）等。
• 缺点：
动物细胞生产周期长，培养条件苛刻等
二. 大肠杆菌中的基因表达
大肠杆菌应用最广泛、最成功的表达 体系，常常作为高效表达的首选体系
1.载体
• 载体的作用是把外源DNA带进宿主细胞，并使
之在细胞内建立稳定的遗传状态，在细胞内繁 殖、传代或进行表达。 • 载体主要有质粒、粘性末端质粒、噬菌体和病 毒。 • 载体按照其用途可分为：克隆载体、表达载体、 转移载体、探针载体。
pRSET
2.影响目的基因在大肠杆菌中表达的
因素
（1）外源基因的拷贝数:高拷贝的表达质粒 （2）外源基因的表达效率： 强启动子 核糖体结合位点（RBS）有效性 SD序列和起始密码ATG的间距 选择偏爱的密码子 （3）表达产物稳定性,不易被降解 （4）细胞的代谢负荷：防止表达产物的毒性 （5）优化工程菌的培养条件
Gene
DNA
Vector
mRNA
Host cell
protein
tet四环素诱导产生的a-synuclein蛋白质
一. 宿主细胞的选择
• 对宿主细胞的要求：
容易获得较高浓度的细胞，能利用价廉易得 原料，不产生内毒素、不致病，需氧低，发热量 低，适当的发酵温度，易进行代谢调控，易进行 DNA重组技术操作，产物的产量、产率高，易进 行分离纯化等。
于二硫键的正确形成。
信号肽序列
• 信号肽：15-30个疏水Aa残基组成，N-端的小段肽链
是以带正电荷的赖氨酸和精氨酸为特征，随后是以疏 水Aa为主的肽段，在邻近切割位点处常有几个侧链很 短的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸等。
• N–端带正电荷的一段：有助于新生肽链与带负电荷的 细胞质膜结合； • 疏水肽段：能形成α-螺旋结构，两段螺旋以反平行的 方式形成发夹结构之后，容易进入内膜的脂双层； • 邻近切割位点的氨基酸：倾向于形成β-折叠，这可能 是信号肽酶所识别的结构。 • 信号肽后面的氨基酸：也影响蛋白质的穿膜和随后的 切割。
1mL GST洗脱缓冲液 （ 50mmol/L Tris· ， Cl
pH8.0/ 5mmol/L还原型谷胱甘肽）洗脱融合蛋白。混 匀2min,500g离心10s，收集上清液。重复洗脱二三 次，经SDS-PAGE分析各分部收集的样品。洗脱的蛋 白质分成小份，加甘油10%贮存于-70℃。
(2) 药物蛋白基因的非融合表达
第三章 基因工程制药
生物信息和疾病
复制
3.5 目的基因表达
DNA
转录
病毒细菌 入
体细胞基
RNA
翻译
基因突变
多基因突
蛋白质
基因功能 ？？？
合成目的基因产物包括转录、翻译、加工 等过程，首先使目的基因编码序列在RNA聚合酶 催化下转录成mRNA，mRNA与核糖体结合，由 tRNA将氨基酸引入，按mRNA的遗传信息翻译为 多肽。通常，新生多肽需经过翻译后加工，如 糖基化、磷酸化等才能成为有功能的蛋白。
价值的信全不致病；表达
的蛋白基本能正确折叠,不形成包涵体
异源和同源蛋白在芽孢杆菌表达的实例
2.真核细胞表达体系
(1)酵母表达体系 主要优点：
①强启动子可促使外源基因达到高效表达,如明 胶表达量可高达14.8g/L;
eg.乙肝，干扰素等
②高密度培养, 可使菌丝干重达到100g/L甚至
（3）药物蛋白基因的分泌型表达
细胞外膜蛋白、周质蛋白、内膜蛋
白以带有N-端信号肽的前体形式在细胞
质中合成，随后穿膜运送到周质或定位
到内、外膜上。在穿膜的过程中，信号
肽被信号肽酶切除。
信号肽 + 外源基因