国家重点基础研究发展计划
（973计划）课题6任务书
一、研究内容
宿主主要通过TLRs和NLRs等模式识别受体对侵入病原进行识别，并经相应信号转导通路精细调控针对不同病原的先天免疫细胞激活、细胞因子分泌、Th细胞极化、胞外陷阱、细胞自噬等先天免疫应答反应，以清除侵入病原。
本课题针对宿主抗寄生虫感染先天免疫信号转导通路这一关键科学问题，分别以新孢子虫、泰勒虫等原虫，捻转血矛线虫、片形吸虫等蠕虫为研究对象，以期在牛羊抗寄生虫感染先天免疫研究方面取得突破。
研究内容：
1．宿主抗寄生虫感染先天免疫TLRs信号转导通路：
（1）参与识别寄生虫的TLRs分子及下游信号通路的鉴定：
利用免疫组学等技术，鉴定宿主参与识别新孢子虫、泰勒虫、捻转血矛线虫及片形吸虫的TLRs分子及相应信号通路。
（2）TLRs信号通路下游核转录因子及细胞因子的检测：
利用免疫芯片等技术，分别对新孢子虫等上述4种寄生虫感染时宿主TLRs 信号通路下游核转录因子激活及细胞因子分泌进行检测。
（3）TLRs信号通路对宿主先天免疫应答反应的影响：
利用基因敲除等技术，选择性激活或阻断TLRs信号转导通路，观察寄生虫对先天免疫细胞激活、Th细胞极化、细胞自噬或胞外陷阱等免疫应答反应的影响，发现提高宿主抗上述4种寄生虫感染能力的TLRs信号转导通路的关键干预节点。
2．宿主抗寄生虫感染先天免疫NLRs信号转导通路：
（1）参与识别寄生虫NLRs分子的鉴定：
利用免疫组学等技术，鉴定参与识别新孢子虫等上述4种寄生虫的NLRs中NOD家族和NALP家族成员分子。
（2）NLRs信号转导通路下游核转录因子、炎症小体及细胞因子的检测：利用免疫芯片等技术，检测宿主感染上述4种寄生虫后，NOD家族信号转导
通路核转录因子激活及细胞因子分泌；检测NALP家族通路下游炎症小体的形成。
（3）NLRs信号转导通路对宿主先天免疫应答反应的影响：
利用RNAi等技术，选择性激活或阻断NLRs信号，观察对免疫细胞激活、Th 细胞极化、细胞自噬或胞外陷阱等免疫应答反应的影响，发现提高宿主抗寄生虫感染能力的NLRs信号转导通路的关键干预节点。
创新点和特色：
本课题运用免疫组学、基因敲除等技术，以新孢子虫、泰勒虫、捻转血矛线虫及片形吸虫等为研究对象，探索宿主先天免疫信号转导在Th细胞极化、细胞自噬或胞外陷阱等先天免疫应答中的作用机制，以期发现提高宿主抗寄生虫感染能力的信号转导通路关键干预节点，将有助于深入阐明宿主抗寄生虫感染的先天免疫机制，从而为寻找诊断、预防和治疗家畜寄生虫病的临床新策略提供重要的理论基础。
二、预期目标
1、鉴定牛羊参与识别新孢子虫、泰勒虫、捻转血矛线虫、片形吸虫等寄生虫相关信号的TLRs和NLRs信号转导通路及核转录因子激活、细胞因子分泌或炎症小体形成特征。
2、阐明牛羊TLRs和NLRs信号转导通路对免疫细胞激活、Th细胞极化、细胞自噬或胞外陷阱等先天免疫应答的调控机制，发现提高牛羊抵抗上述4种寄生虫感染信号转导通路的关键干预节点。
3、发表SCI论文12～15篇，申请专利2～3项。
4、培养学术带头人1～2名、学术骨干2～3名、博士后1～2名、博士及硕士研究生12～15名。
三、研究方案及技术路线
研究方案：
1．宿主抗寄生虫感染先天免疫TLRs信号转导通路：
（1）参与识别寄生虫的TLRs分子及下游信号通路的鉴定：
1）建立寄生虫感染宿主细胞体外培养方法，接种虫体(或产物) 后检测TLRs
受体表达变化及下游信号转导通路激活情况，初步鉴定宿主TLRs激活的种类。
2）构建转染宿主TLRs基因的TLR-HKE293细胞，接种虫体(或产物)后，进一步确定寄生虫激活宿主TLRs的种类。
（2）TLRs信号通路下游核转录因子及细胞因子的检测：
1）利用免疫芯片、激光共聚焦等技术，分别对虫体激活的宿主TLRs信号通路下游接头分子变化，以及NF-κB等核转录因子入核情况进行检测。
2）利用RT-PCR及ELISA等方法，对寄生虫通过激活宿主细胞TLRs信号通路诱导的细胞因子进行检测。
（3）TLRs信号通路对宿主先天免疫应答反应的影响：
1）利用流式细胞、激光共聚焦等手段，观察接种虫体(或产物)后宿主Th细胞极化、细胞自噬或胞外陷阱等抗寄生虫感染应答反应情况。
2)利用寄生虫感染体外模型或小鼠模型，选择性激活或阻断TLRs信号转导通路不同节点后，观察宿主Th细胞极化、细胞自噬或胞外陷阱等应答反应变化。
3）体内选择性激活或阻断TLRs信号转导通路不同节点，观察宿主抗寄生虫感染能力的变化。
2．宿主抗寄生虫感染先天免疫NLRs信号转导通路：
（1）参与识别寄生虫的宿主NLRs分子的鉴定
1）体外培养宿主细胞,后接种虫体(或产物)，检测其NLRs受体中被激活的NOD 和NALP家族成员分子种类。
2）利用基因敲除等手段，确定寄生虫激活宿主细胞NLRs分子种类。
（2）NLRs信号转导通路下游核转录因子、炎症小体及细胞因子的检测：1）利用免疫芯片等技术，检测虫体(或产物)激活宿主细胞NOD家族信号转导通路下游接头蛋白、核转录因子入核变化情况及细胞因子分泌特征。
2）利用免疫印迹，蛋白芯片等技术，检测虫体(或产物)激活宿主细胞NALP 家族通路下游炎症小体的形成特征。
（3）NLRs信号转导通路对宿主先天免疫应答反应的影响：
1）利用寄生虫感染体外模型或小鼠模型，选择性激活或阻断NLRs信号转导通路不同节点，观察宿主Th细胞极化、细胞自噬或胞外陷阱等应答反应变化。
2)体内选择性激活或阻断NLRs信号转导通路不同节点，观察宿主抗寄生虫感染能力的变化。
技术路线：
可行性分析:
支撑条件：本课题由吉林大学、中国农业大学和中国农业科学院兰州兽医研究所共同承担。
吉林大学为“985工程”和“211工程”高校，预防兽医学学科为国家重点学科，拥有人兽共患病研究教育部重点实验室以及“985”工程动物科技创新平台。
中国农业大学为“985工程”和“211工程”高校，拥有农业部人畜共患病重点实验室，“985”工程动物重大疫病防治研究科技创新平台。
中国农业科学院兰州兽医研究所拥有家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部动物疫病病原生物学重点实验室，农业部草食动物疫病重点开放实验室，农业部兽医公共卫生重点开放实验室，甘肃省动物寄生虫病重点实验室等研究平台。
课题承担单位拥有开展本课题所需工作条件。
技术力量：本课题骨干成员都具有从事课题相关寄生虫研究的丰富经验，主
持过相关课题研究，掌握寄生虫学科前沿和国内外研究动态，具有开展新孢子虫、泰勒虫、捻转血矛线虫和片形吸虫研究的扎实理论基础和丰富的科研经验。
课题组主要成员在本研究领域也具备扎实的寄生虫学、分子生物学、免疫学理论基础和研究经验，已熟练掌握了寄生虫免疫研究相关的试验方法和技术，在人员构成和技术上能保证本课题的顺利开展。
工作基础：研究发现新孢子虫可以刺激免疫细胞产生高水平NO、IFN-γ和IL-12，协同CpG激活TLR9，从而证明新孢子虫可以与CpG协同通过TLR9途径介导机体Th1型免疫应答。
初步证明NcHMGB1是一种炎症刺激因子，协同CpG 通过TLR9途径介导新孢子虫Th1型免疫应答。
以上研究成果为进一步研究宿主抗寄生虫感染先天免疫信号转导通路及作用机制奠定了坚实基础。
相关研究成果发表于Parasitol Res、Vet Parasitol等杂志。
四、年度计划
五、课题承担人员。