技术·食品工程＞＞＞C酶法提取枸杞多糖工艺研究梁敏1邹东恢1，2郭建华1，2（1．齐齐哈尔大学2．黑龙江省普通高校齐齐哈尔大学农产品加工重点实验室）【摘要】本文研究了酶法提取枸杞多糖的最佳工艺条件以及枸杞中多糖的分离方法。
采用木瓜蛋白酶处理，对作用温度、加酶量、最适pH值、作用时间进行正交试验。
确定了酶法提取枸杞多糖的最佳工艺：加酶量0．3％，酶解反应的pH值为7．0，温度为45℃，反应时间为2h，提取率可达14．9％。
【关键词】枸杞多糖；酶法提取；正交试验；工艺中图分类号：TS255．7文献标识码：A文章编号：1673-7199(2010)03-0104-03枸杞子为茄科植物枸杞的成熟果实，是我国传统的滋补中药材。
《本草纲目》中记载枸杞子具有坚筋骨、补精气诸不足、明目安神、令人长寿等功效。
目前人们对枸杞子多糖进行了较广泛的研究，发现枸杞多糖具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、抗疲劳、护肝、防辐射、抗缺氧等功效，且无任何毒副作用，因此枸杞多糖的分离纯化及其药理作用研究已成为一个热点课题。
近年来生物酶广泛应用于各个领域，在国内也开始将其应用于药物提取中，枸杞多糖通常被包裹在植物细胞壁内，并且多糖往往和蛋白质结合在一起，以蛋白多糖的形式存在。
研究表明中性蛋白酶能有效酶解与多糖结合在一起的蛋白质，从而将多糖释放出来而提高多糖的得率，提高了多糖的纯度，对枸杞多糖的研究开发具有现实意义。
1试验方法与工艺过程1．1试验原料从市场中购得新鲜枸杞，清洗干净，去除杂质，之后适当切块放入真空干燥箱干燥，待枸杞恒重，放入粉碎机中粉碎，将粉碎后的枸杞粉依次通过40、60、80、100目的筛，过筛之后把各级枸杞粉分别装到清洁干燥的烧杯中，置于真空干燥箱中待用。
1．2试验试剂与仪器木瓜蛋白酶，北京世纪时尚科贸有限公司；Sephadex G－75，Pharmacia；苯酚，天津市科密欧化学试剂开发中心；葡萄糖、活性炭，天津市凯通化学试剂有限公司；使用试剂均为分析纯。
真空干燥箱，上海益恒试验仪器有限公司；电热恒温水浴锅、离心机、透析袋、THZ－82A台式恒温振荡器，上海跃进医疗器械厂；HL－2S恒流泵，上海青浦沪仪器厂；九阳料理机，山东九阳小家电有限公司；SHZ－D（III）循环水式真空泵、722紫外分光光度计、PB－10pH计，北京赛多利斯仪器系统有限公司；BSZ－100自动部分收集器，上海沪西仪器厂；Lambda－35紫外可见分光光度计，美国PE公司。
1．3试验方法与步骤称取80目的枸杞粉3g，放入到250mL的三角瓶中，然后加蒸馏水35mL混合均匀后置于40℃水浴锅中，水浴30min，调节pH值，加入一定比例木瓜蛋白酶混合，加入5mL蒸馏水溶解，枸杞溶液放在水浴中预热至酶解温度，将酶液加入到枸杞溶液中，在恒温振荡器上提取，反应结束，将三角瓶放到沸水锅中，10min沸水浴灭酶，灭酶结束，冷却至室温，将酶提取液放入到离心管中，调至5000r／min离心，取上清液，即得到酶提取多糖清液。
1．4葡萄糖标准曲线的制定以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，绘制标准曲线，获得线性回归方程。
直线方程为：Y＝104C ＜＜＜食品工程·技术表1酶法提取枸杞多糖正交试验结果试验号加酶量A （％）温度B （℃）pH 值C时间D （h ）多糖提取率（％）11（0．3）1（35）1（5．0）1（1）12．6212（45）2（6．0）2（2）14．6313（55）3（7．0）3（3）13．742（0．2）12312．35223113．06231213．373（0．1）13213．18321311．09332110．7K 140．938．036．936．3K 238．638．637．641．0K 334．837．739．837．0k 113．612．712．312．1k 212．912．912．513．7k 311．612．613．312．3R2．00．31．01．6图1粒度对枸杞多糖提取率的影响图2料液比对枸杞多糖提取率的影响0．5528X ＋0．0114，回归系数为0．9961，在5～50μg ／mL 范围内呈良好的线性关系。
1．5多糖总量的测定采用苯酚－硫酸比色法，在490nm 波长处测定吸光度，再通过已经测定的葡萄糖标准曲线计算求得枸杞中的多糖含量。
1．6蛋白质去除方法采用Sevag 法去除粗多糖中的蛋白质。
1．7多糖的分离提取枸杞多糖在NaOH 水溶液中溶解度大，所以先用0．5％氢氧化钠初步提取，之后取清液，用透析袋透析去除杂离子，透析后去除杂蛋白，2％浓度活性炭脱色1h ，加入无水乙醇，使溶液中乙醇的浓度达到75％进行醇沉，醇沉过程中要将其保存在4℃冰箱中，保持24h ，4500r ／min 离心15min ，取沉淀，置于真空干燥箱中干燥，即可得到枸杞粗多糖。
1．8多糖的纯化枸杞多糖粗品水溶解后用SephadexG－75色谱分离，干燥获得纯枸杞多糖。
2结果与讨论2．1物料粒度对枸杞多糖提取率的影响物料粒度对提取率将有较大影响，将粉碎后的枸杞粉依次通过40、60、80、100目的筛，得到40以下、40～60、60～80、80～100、100目粒度以上的样品，取一定量样品，选择料液比1∶15，温度45℃水浴中浸提1h ，结果如图1所示，80～100目粒度物料多糖提取率最高。
2．2料液比对枸杞多糖提取率的影响选择料液比1∶l0、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，分别于45℃水浴中浸提1h ，枸杞多糖提取率（％）分别为2．4、3．2、3．5、3．6、3．6，结果如图2所示，当料液比在1∶15～l∶25之间多糖提取率增长较快，继续提高料液比多糖提取率仍有升高，但提高速率减小。
对料液比的选择，若加水太少提取不彻底；加水太多，降低了提取液的固形物含量，不利于以后的分离，而且加重了生产中负担，因此试验确定料液比为1∶25。
2．3正交试验结果影响枸杞多糖的提取因素很多，通过预试验选择其中的4个因素作为研究的对象：加酶量（对底物）、酶解温度、pH 值、反应时间。
每一个因素又包括3个水平，选择四因素三水平正交试验，试验结果见表1。
由表1可知：按极差的大小顺序是A＞D＞C＞B ，以A 为主要因素，D 次之，C 再次之，B 是次要因素。
经比较4个因素的不同水平下的各自的平均值，发现A 1D 2C 3B 2在每个因素的4个水平下对枸杞多糖的提取率105技术·食品工程＞＞＞C 图3SephadexG－75色谱分离图图4枸杞多糖紫外吸收图谱的提高最大，由此确定枸杞多糖的提取率的最优条件为A 1D 2C 3B 2。
通过正交试验得到酶法提取枸杞多糖的最佳工艺条件为：加木瓜蛋白酶0．3％，酶解温度45℃，pH 值7．0，反应时间2h ，采用酶法工艺优化得到多糖的提取率为14．9％。
2．4色谱分离样品制备（1）待纯化样液的制备：称取干燥后的粗多糖50mg ，在100mL 容量瓶中定容。
（2）色谱柱：柱长80cm ，直径2．0cm 。
装柱60cm ，填充物为SephadexG－75。
洗脱液为0．05moL ／L 的NaCl ，在流速5mL ／h 下平衡72h 。
取粗多糖10mL ，上柱。
用恒流泵控制流速（15mL ／h ），自动部分收集器收集，每管收集2．0mL ，用苯酚－硫酸法测定各洗脱液490nm 处吸光度，由吸收曲线得到一个吸收峰，收集其流出液，冷冻干燥得到纯化样品。
2．5枸杞多糖紫外吸收分析紫外吸收光谱应用很广，可用于有机化合物的结构表征和有机化合物定量分析。
由于此法灵敏度高，能检查出10－4～10－5moL ／L 甚至10－6～10－7moL ／L 浓度的化合物，因此在本试验中采用此法测定其中的微量杂质蛋白质，结果如图3所示。
采用美国PE 公司的Lambda－35紫外可见分光光度计，在190．0～1000．0nm 范围内对提取的枸杞多糖进行紫外光谱扫描，从多糖紫外吸收图谱（图4）上可见扫描吸收曲线较为光滑，在280nm 处的曲线未出现峰值，所以蛋白质的含量非常微小。
3结论（1）本试验采用木瓜蛋白酶处理枸杞，得到优化试验条件为：加木瓜蛋白酶量为0．3％，酶解反应的温度为45℃，pH 值为7．0，反应时间为2h ，提取率为14．9％，采用酶法提取枸杞多糖相比于传统工艺提取率提高65．6％。
（2）多糖样品的紫外扫描得到的紫外吸收图谱可以看出在280nm 处的曲线未出现剧烈波动或峰值，所以采用此法提取的枸杞多糖产品中蛋白质的含量微小，为进一步提取制备枸杞多糖的研究提供一定的参考。
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通信地址：（161006）齐齐哈尔市文化大街42号106。