不同工艺的枸杞多糖提取率比较及其体外抗氧化性研究 枸杞多糖是一种优质的水溶性植物多糖，提取自宁夏枸杞的果实。现代药理研究已表明，枸杞多糖能够改善老年人易疲劳、食欲不振、视力模糊等症状，同时还是枸杞子中调节人体免疫、延缓衰老的主要活性成分。 枸杞多糖作为西安源森生物公司的主打产品，已被广泛应用于食品饮料以及保健品领域。为向客户提供更高品质的产品，日前，西安源森生物实验室就枸杞多糖的不同提取工艺进行对比研究，并对枸杞多糖体外抗氧化性进行了测定。 实验概述: 1. 西安源森生物实验室分别用三种提取方法：浸泡提取法、超声波提取法

和微波提取法提取枸杞多糖；然后采用硫酸 - 苯酚法对多糖含量进行定性定量分析，得出不同提取方法所得的枸杞多糖含量及提取率； 2. 根据枸杞粗多糖对自由基的清除率以及对超氧阴离子的清除作用的测定，比较同浓度条件下的 VC 与枸杞多糖对抗氧化活性。枸杞多糖体外抗氧化性结论。

一、三种提取方法提取枸杞多糖的提取率研究 （一）实验材料与试剂 1. 材料 宁夏枸杞 西安源森生物实验室自产地直接采购； 2. 试剂 （1）5% 苯酚； （2）8mmol/L HCl；25mmol/L 邻苯三酚溶液； （3）0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2)；10%三氯乙酸； （4）邻苯三酚(焦性没食子酸，分析纯)； （5）三羟基甲基氨基甲烷(Tris)(分析纯)； （6）1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl, DPPH)。 （二）仪器与设备 （1）索氏提取装置，HH-S 数显恒温水浴锅； （2）YHW-102 型远红外干燥箱； （3）KQ3200 型超声波清洗仪； （4）WFJ-7200 型可见光分光光度计； （5）LDZ5-2 低速自动平衡离心机； （6）WP700 型微波炉； （7）TU-1900 双光束紫外可见分光光度计； （8）DL-1 万用电炉规格(单联电压220V，功率：LX/KW)； （9）ZDHW 型调温电热套(规格 250ml，功率 150W)； （10）JA2003 型电子天平。 （三）实验步骤 1.枸杞预处理 将宁夏枸杞放于60℃恒温箱中恒温干燥24h→称量→剪碎→回流脱脂（回流两次，每次3 h）→弃去溶剂，残渣风干，残渣即为经过预处理的枸杞。 2. 利用三种方法进行枸杞多糖的提取 （1）浸泡法提枸杞多糖 用电子天平称取等量经预处理后的枸杞，浸泡3h，然后用90℃的水浴提取1.5h，用脱脂棉过滤，重复提取3 次，弃去残渣，合并滤液，浓缩，离心(3000r/min，30min)，弃去残渣，上清液为多糖溶液。 （2）超声波法提取枸杞多糖 用电子天平称取等量经预处理后的枸杞，置超声波清洗仪中，40℃恒温超声波提取 1h，脱脂棉过滤，重复提取3 次，弃去残渣，合并滤液，浓缩，离心(3000r/min，30min)，弃去残渣，上清液为多糖溶液。 （3）微波法提取枸杞多糖 用电子天平称取等量经预处理后的枸杞，置于微波炉中加热提取2 0 m i n ，脱脂棉过滤，重复提取3 次，弃去残渣，合并滤液，浓缩，离心(3000r/min，30min)，弃去残渣，上清液为多糖溶液。 3. 三氯乙酸法去除蛋白质 在枸杞多糖水溶液中加入 10% 三氯乙酸，调节 pH 至3，在 10℃条件下放置过夜，离心(3000r/min，30min)，弃去沉淀，即得无蛋白质的多糖溶液（待测样品溶液）。 4. 枸杞多糖沉淀 向除去蛋白质的枸杞多糖溶液中加入4 倍体积的95%乙醇沉淀，静置24h，离心(3000r/min，30min)，弃去上清夜，固态物用 9 5 %乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚依次进行洗涤，颜色分别由黄色洗至近无色，后置于 6 0 ℃恒温干燥2 4 h ，即为枸杞多糖粗品。 5. 多糖再沉淀 将枸杞多糖粗品溶于热水中使其完全溶解，过滤弃去沉淀，浓缩溶液，向枸杞多糖溶液中加入4 倍体积的95%乙醇沉淀，静置24h。离心(3000r/min，30min)，弃去上清液，固态物用9 5 %乙醇、无水乙醇、丙酮和乙醚依次进行洗涤，颜色洗至近无色，于 6 0 ℃恒温干燥2 4 h ，即为枸杞多糖。 （四） 标准曲线的绘制 1. 葡萄糖标准溶液配制 2. 标准曲线绘制 编号为 1、2、3 、4 、5 、6的具塞试管中为精确量取的标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml。其中，1 号试管为空白对照溶液。 试管中分别加水至2.0ml，分别精确加入5% 苯酚溶液1.0ml（摇匀）→迅速加入浓硫酸 5.0ml（摇匀）→放置 10min→置 40℃水浴中保温15min→取出后迅速冷却至室温。 用紫外-可见分光光度法在 490nm 的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：y=0.107x+0.1202，r=0.9992(n=5)(图1)。 可以看出，吸光度随着葡萄糖溶液浓度的变化而呈线性变化。用测定得到的吸光度，根据线性回归方程 y=0.107x+0.1202 计算多糖溶液中葡萄糖的浓度。 3. 换算因子的测定 精确称取于60℃恒温箱干燥至恒重的、经过再沉淀的枸杞多糖20mg，置于 100ml 容量瓶中，用适量蒸馏水水溶解后，定容至刻度线，摇匀，作为枸杞多糖储备液。 精确量取枸杞多糖储备液1.0ml加水至2.0ml，按照标准曲线的绘制方法测定其吸光度。按照下式计算换算因子F 测得 F=1.67。

其中，D 为多糖的稀释因素；C 为多糖稀释液中葡萄糖的浓度(mg/ml)；W 为枸杞多糖的质量(mg)。 4. 样品溶液的制备 用电子天平称取经预处理后的枸杞，于回流装置中回流脱脂（两次，每次3 h）→弃去溶剂，残渣风干→以 80%乙醇300ml 回流脱单糖两次，每次 3h→回收乙醇。 向残渣中加入450ml 蒸馏水，在不同的条件下(浸泡提取、超声波提取、微波提取) 提取( 三次) →过滤→合并滤液→浓缩，离心(3000r/min，30min)→弃去残渣，上清液为多糖水溶液。 再向枸杞多糖水溶液中加入10%三氯乙酸→调节pH至3→静置24h，离心(3000r/min，10min)→弃去沉淀，即为无蛋白质的待测多糖溶液。 （五）枸杞多糖含量测定 精确吸取样品溶液1.0ml→加蒸馏水至2.0ml→再加入1.0ml 5% 苯酚溶液（摇匀）→迅速加入浓硫酸5.0ml（摇匀）→放置 10min→置 40℃水浴保温 15min→迅速冷却至室温。 在紫外-可见分光光度 490nm 处测吸光度，按以下公式计算样品溶液中多糖的含量。 其中，W 为供试样品重量(mg)；F 为换算因子；D为供试溶液的稀释倍数；C 为供试溶液中葡萄糖的浓度(mg/ml)。 （六）三种枸杞多糖提取提取率实验结果分析 1. 标准曲线（图1） 根据（四）.2中线性回归方程 y=0.107x+0.1202 计算多糖溶液中葡萄糖的浓度。然后根据公式(2)计算枸杞多糖(LBP)的含量。 2. 三种提取方法：浸泡提取法、超声波提取法和微波提取法提取枸杞多糖的比较结果 实验中分别采用浸泡提取法、超声波提取法、微波提取法来提取枸杞多糖，并用硫酸 - 苯酚法测定多糖含量(表1)。

可以看出，在浸泡提取、超声波提取和微波提取三种提取方法中： 微波炉提取法的多糖含量最高—— 22.62%； 超声波法提取的多糖含量——19.45%； 浸泡提取法的多糖含量最小—— 16.90%。 造成枸杞多糖这种提取效率差异的主要原因是由于提取的原理不同，因此可见微波提取枸杞多糖的方法最佳。

二、枸杞多糖体外抗氧活性的测定实验 在正常的代谢过程或不利的外界环境影响下，细胞都会产生自由基，而过量的自由基会对人体内的糖类、蛋白质、核酸和脂质等生命分子造成很大的损害，进而引起中风、癌症等疾病。 此部分实验，就是针对枸杞多糖的清除自由基能力及体外抗氧化性进行研究： （一）DPPH 自由基体系 精确称取经再沉淀的枸杞多糖，用适量蒸馏水充分溶解，制成浓度为 1.0mg/ml 的母液 A。取母液A 稀释至浓度分别为0.8、0.6、0.4、0.2mg/ml，分别编号①～⑤。 精确称取抗坏血酸定容，制成浓度为1.0mg/ml VC母液B。取母液B稀释至浓度分别为 0.8、0.6、0.4、0.2mg/ml，分别编号⑥～⑩。 （1）分别精确量取2ml浓度为2.0×10-4mol/L的DPPH溶液与蒸馏水混合，以相对应的溶剂为对照，用紫外可见分光光度计分别测定上述溶液在波长为 517nm 处的吸光度(Ac)。 （2） 分别精确量取不同浓度枸杞多糖溶液、抗坏血酸溶液各 2ml，将其分别与2 ml相对应的溶剂混合均匀后，以溶剂为对照，用紫外可见分光光度计分别测定上述溶液在波长为 517nm 处的吸光度(Aj)，分别得到10 个Aj值。 （3） 分别精确量取不同浓度枸杞多糖溶液、抗坏血酸溶液各2ml，并将其分别与2ml 浓度为2.0 ×10-4mol/L 的DPPH溶液混合，摇匀后放置30min，以相对应的溶剂为对照，用紫外可见分光光度计分别测定上述溶液在波长为 517nm处的吸光度(Ai)，分别得到10个Ai值。 枸杞多糖、抗坏血酸的抑制率计算公式为：

（二） 超氧阴离子自由基体系 按照“DPPH 自由基体系”中的方法配制枸杞多糖和抗坏血酸溶液分别编号①～⑩。 取0.05mol/L的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(pH8.2)4.5ml→置25℃水浴中预热20min→分别加入1ml试样溶液和0.4ml 25mmol/L邻苯三酚溶液（混匀）→于 25℃水浴中反应 5min→加入 8mmol/L HCl 1ml终止反应。 之后在TU-1900 型双光束紫外-可见分光光度计下299nm 处测定溶液的吸光度(Ai)，空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品溶液，在紫外可见分光光度计下299nm 处测定溶液的吸光度(A0)，每个试样作三个平行样，取其平均值。 将测得的数据代入下列公式计算清除率(P)。

（三） 枸杞多糖的稳定性实验 取待测样品溶液，照样品溶液测定方法操作，在紫外-可见光分光光度计下测定其吸光度，所测定时间间隔为 0 、1 、3 、5 、7 、9 h 。以所得的吸光度作为考察因素，以此衡量枸杞多糖的稳定性。 （四）枸杞多糖体外抗氧活性的测定实验结果与分析 1. 枸杞多糖对 DPPH 自由基的清除作用

根据公式(3)计算枸杞多糖与VC溶液对DPPH 自由基的清除率。 计算结果表明，枸杞多糖和V C对DPPH自由基均有清除作用。 表2显示，V C 溶液在该浓度范围内对 D P P H 自由基的抑制率基本没有变化，且均大于92%；而浓度为0.2～1.0mg/ml的枸杞多糖对 DPPH 自由基的清除率在43.09%～76.21%，并