植物遗传转化大实验
一、实验目的与原理简介
农杆菌介导的遗传转化系统是外源DNA进入植物细胞的最成功和应用最广泛的方法，农杆菌可浸染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，甚至裸子植物。

转化植物细胞的农杆菌主要有两类，即根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。

已有研究表明，影响农杆菌介导植物基因转化的因素很多，农杆菌菌株、植物基因型和外植体、培养方法、不同的选择标记等因素都影响农杆菌介导的遗传转化。

目前报道已有许多植物通过农杆菌的遗传转化获得了转基因植株或毛状根。

二、发根农杆菌介导的遗传转化步骤
1．无菌组织的培养
取组培苗幼嫩叶片，在超净工作台中切成0.5x0.5cm的方块，并在叶片上刻痕，接种于愈伤诱导培养基中，暗培养3周后作为受体。

在农杆菌浸染前，将愈伤组织在无菌条件下切割成小块在愈伤诱导培养基上分别预培养，增加受体细胞的活性进而提高转化率。

2．农杆菌的培养
在转化平板上挑取c58c1单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。

在50ml农杆菌培养基（含相应抗生素）中加入1ml上述培养物，200rpm，28℃振荡培养过夜；室温下4000rpm, 10min，弃上清夜，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600=0.5左右。

3．共培养
剪取无菌苗的叶片和茎段，放入发根农杆菌MS悬液中浸泡5min，倒出悬液，用无菌吸水纸吸干表面余菌，转到共培养培养基MS上，光照培养2天。

4．毛状根的诱导和培养
将共培养的外植体转入到1/2 MS + Cef 500mg/L培养基上光照培养。

随时检测外植体的染菌情况，如出现细菌生长过多，须马上转移到新筛选培养基中培养。

20天左右即可长出毛状根，剪取毛状根，接种于1/2 MS + Cb 250mg/L培养基上暗培养数周，选择生长快、分枝好的毛状根转入脱菌筛选培养基中继代筛选。

三、毛状根的分子鉴定
1、毛状根基因组DNA提取。

（采用CTAB法小量提取）。

2、转化基因PCR鉴定。

四、实验说明
能否成功地获得转基因植物，取决于起始材料对农杆菌的感受性、对转化细胞形成的新生组织的选择能力以及中选组织的再生能力。

遗传转化时应该注意以下几点：
1、对农杆菌进行必要的诱导处理，注意培养条件、菌液浓度、侵染和共培养的
时间等，在提高瞬时表达的同时要防止细菌的过度生长；
2、对再生植株的细胞起源需有明确的了解，在培养方法、培养基的设计上要有
利于转化细胞的生长、分裂及植株再生；。