基于亚甲基蓝荧光特性研制的近红外荧光成像系统黄陆茂;杜佩妍;陈兰;张洒;周地福;陈春林;辛学刚【摘要】目的基于亚甲基蓝的荧光特性研制近红外荧光成像系统并开展相关实验以证实该系统的可行性.方法首先,根据亚甲基蓝的光学特性,分别定制特定LED光源与干涉滤光片,及CCD相机等相关的零部件,并进行近红外荧光成像设备的搭建.其次,利用研制的近红外荧光成像系统进行亚甲基蓝近红外荧光成像实验,并分析计算各种不同实验条件下的亚甲基蓝的SBR (Signal-to-background ratio)值及进行数据统计分析.最后,初步开展wistar鼠尿液收集实验,15只wistar鼠随机分成5组,每组分别给予尾静脉注射不同剂量的亚甲基蓝注射液(剂量分别为0、2、1.8、1.6、1.4 mg/kg),收集尿液,并将收集的尿液进行近红外荧光成像及分析各个剂量组的SBR值,并采用单因素方差分析.结果 MB的SBR值受浓度及成像距离的影响,各种不同实验条件下P值均小于0.05.而不同剂量组wistar鼠尿液的SBR值随剂量的减小呈现先增大后减小,其中1.6 mg/kg的剂量组SBR值(8.71±0.20)最高,且不同剂量与SBR值具有显著性差异(P<0.05).结论该系统可用于亚甲基蓝荧光的探测,有望进一步应用于腹部术中输尿管实时识别的研究.%Objective To develop a near-infrared fluorescence imaging system based on the fluorescence properties of methylene blue. Methods According to the optical properties of methylene blue, we used a custom-made specific LED light source and an interference filter, a CCD camera and other relevant components to construct the near-infrared fluorescence imaging system. We tested the signal-to-background ratio (SBR) of this imaging system for detecting methylene blue under different experimental conditions and analyzed the SBR in urine samples collected from 15 Wistar rats with intravenousinjection of methylene blue at the doses of 0, 1.4, 1.6, 1.8, or 2.0 0 mg/kg methylene blue. Results The SBR of this imaging system for detecting methylene blue was affected by the concentration of methylene blue and the distance from the sample(P<0.05).In the urine samples from Wistar rats,the SBR varied with the the injection dose,and the rats injected with 1.6 mg/kg methylene blue showed the highest SBR(8.71±0.20)in the urine(P<0.05).Conclusion This near-infrared fluorescence imaging system is useful for fluorescence detection of methylene blue and can be used for real-time recognition of ureters during abdominal surgery.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2018(038)004【总页数】7页(P414-420)【关键词】输尿管;亚甲基蓝;近红外荧光成像系统【作者】黄陆茂;杜佩妍;陈兰;张洒;周地福;陈春林;辛学刚【作者单位】南方医科大学生物医学工程学院医学工程系,广东广州510515;南方医科大学南方医院妇产科,广东广州510515;南方医科大学南方医院妇产科,广东广州510515;南方医科大学生物医学工程学院医学工程系,广东广州510515;南方医科大学生物医学工程学院医学工程系,广东广州510515;南方医科大学南方医院妇产科,广东广州510515;南方医科大学生物医学工程学院医学工程系,广东广州510515【正文语种】中文在临床腹部或盆腔外科手术中医源性输尿管损伤，虽然较少见，一旦发生输尿管损伤，将会产生严重的并发症，如腹腔感染、输尿管瘘、肾衰竭等。
据研究报道腹部或盆腔外科手术医源性输尿管损伤的发病率1%～8%［1］，其中盆腔外科手术医源性输尿管损伤最为常见，特别是结直肠手术、妇科手术等［2］。
为了降低医源性输尿管损伤的风险，大量有关输尿管识别定位的成像技术不断涌现，如静脉肾盂造影术（IVP）、逆行性肾盂造影术、泌尿道计算机断层扫描（Uro-CT）、输尿管支架管置入术、运用gamma探测仪技术。
过往技术手段虽然可以实现对输尿管的识别定位，但仍然存在各种缺陷与不足。
尤其前3者是依靠术前对输尿管的定位，转化到术中外科医生常常凭借术前影像信息和实践经验大致判断输尿管的大致走向，缺乏实时性，而且均会对患者会产生电离辐射。
输尿管支架管置入术是在术前向需要进行腹部外科手术的患者体内放置输尿管支架管（或发光的输尿管支架管），术中外科医生通过手或手术器械的触碰和眼睛观察，间接对输尿管进行识别定位，虽然一定程度上实现术中实时输尿管识别定位，但这种有创的方法不仅会额外增加病人的疼痛，并且延长手术时间，增加手术的费用，有些患者术后会产生血尿，尿路感染等症状［3-4］。
而gamma探测技术是通过向患者静脉注射放射性药物（锝），再通过gamma探测以获取输尿管的位置信息，但进行该项操作需要专门安排一个放射核医师，并且会产生电离辐射，长久以往将损害医护人员的健康［5］。
然而，光学成像技术，特别是近红外荧光成像，凭借其可术中实时，无电离辐射，可视化组织解剖结构信息，得到广泛的研究。
如基于吲哚菁绿光学特性的近红外荧光成像技术已经在临床上广泛应用于血管［6-7］、淋巴［8-13］、胆管［14］、肿瘤［15］等术中识别定位。
但是吲哚经静脉注射后，绝大部分是经过肝代谢［16］，因此较少用于泌尿系统的识别定位。
但仍有少数研究人员进行相关研究，如Tanaka等［17］进行向猪泌尿系统逆行性注射10 μmol/L的ICG，结合近红外荧光成像技术，实验结果显示逆行注射后输尿管立即可视。
该方法有待进一步研究实践。
除了吲哚已获得FDA批准可用于临床的近红外荧光染料外，还有亚甲基蓝（MB）也获得FDA的批准［18］。
与吲哚不同的是：一、其经静脉注射后绝大部分是经过肾脏代谢最终以尿液的形式排出体外；二、光学特性，如吸收与发射光谱等，MB吸收峰为665 nm，发射峰为688 nm，刚好落在近红外光（650～900 nm）波段中［19］。
故MB可结合近红外荧光成像技术，实现术中实时在体、无电离辐射，可视化获取输尿管的位置信息。
目前国外已有使用MB结合近红外荧光成像技术实现在动物及人体腹部术中实时在体输尿管可视化的研究报道。
例如相关动物实验研究［19］；2013年Verdeek等［20］进行的首次人体临床试验；2016年Yeung等［21］和Mah diAl-Taher等［22］开展的相关临床相关试验。
但仍存在不足之处：临床数据量还较少，还未能对最佳成像剂量或最佳成像时间下定论，有待进一步扩充试验数据；组织穿透深度较浅，有些需部分暴露输尿管方能探测到MB的荧光信号等。
即腹部术中无电离辐射、无创、实时在体输尿管可视化的研究仍在初级阶段，需要更加深入的研究与探讨。
基于MB光学特性而研制的近红外荧光成像系统是开展术中实时在体输尿管识别定位的前提。
然而，目前国内外能用于MB的荧光成像系统进仅有FLARE近红外成像系统［23］，虽然可以多光谱融合成像，但是集成度高、体积大、费用高、不够轻携。
因此，本文针对MB的光学特性而单独研制相应的近红外荧光成像系统，一是填补国内在这方面的空白，二是为下一步深入研究做好前期准备工作。
1 系统成像原理在介绍系统成像原理之前，首先了解下MB的物理、化学、光学等性质。
1.1 MB的性质MB是一种亲水性的吩噻嗪衍生物，净电荷-1。
化学式：C16H18ClN3S；结构式：如下图1；相对分子质量：319.85。
MB在浓度较高的情况下，主要作为一种显色染料。
但是当它稀释到一定程度时，在特定激发光激发下可以发射出荧光信号。
其吸收峰为665 nm，发射峰为688 nm，刚好落在肉眼不可见的近红外光波段中［19］。
相关研究表明影响组织穿透深度主要是组织对光的吸收与散射［24］。
而在近红外波段中活体组织（主要血红蛋白、水、脂肪）对近红外光呈现低吸收、低散射、低自体荧光的特点，即有一定的组织穿透深度［25］。
其在100%胎牛血清（pH=7.4）中消光系数（extinction coefficient Ɛ）：71 200 M-1cm-1，量子产率（Quantum yield）：3.8%；浓度淬灭（Concentration-Dependent Quenching）值：20 μm［26］。
符合在体组织荧光成像对外源荧光基团性质的要求［26］。
图1 亚甲基蓝的化学结构式Fig.1 Chemical structure of MB.1.2 荧光成像原理根据荧光基团的吸收光谱特性，而发射特定波长的激发光子辐照荧光基团，吸收激发光子能量的荧光基团，受激后的基态分子中电子向高能级轨道跃迁变成激发态，当激发态分子回到基态时，将释放能量，以光子的形式发射（即荧光）。
整个过程是吸收光子与发射光子之间的能量转换，而引起的波长的变化（波长短能量高的吸收光谱转换成波长长能量低的荧光），即斯托克斯位移［27］。
其光子吸收与荧光发射的大致过程如下图2所示。
1.3 近红外荧光成像系统原理近红外荧光成像是近红外激发光源发射激发光辐照目标靶区，靶区内的荧光基团受激发光激发后，发射出的荧光，部分经滤光片、透镜进入CCD相机进行光电转换及一系列的信号后处理，最终将信号强弱用灰度值表示并实时显示在荧屏上。