收集活性高的酶液，测量总体积(ml数) （样品Ⅳ），-20℃保存，用 于蔗糖酶活力测定和蔗糖酶蛋白含量测定电泳分析以及用于用正交法测定几 种因素对蔗糖酶活性的影响（限定性设计）。样品低温－20℃保存。
六、结果分析讨论
下次实验
实验三 蛋白质含量的测定——Folin-酚法 蛋白质含量的测定——Folin——Folin 实验四 蔗糖酶活力测定
三、实验材料与试剂 1、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ 2、实验试剂 ⑴ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液； ⑵ DEAE-Sepharose Fast Flow (弱碱性阴离子交换剂)； ⑶ NaCl ； ⑷ 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 ； ⑸ 5%蔗糖溶液 ； ⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂。
4、装柱(层析柱规格1×20cm)、平衡 ： 装柱(层析柱规格1 20cm)、 装柱前先调好流速0.8ml～1ml/min，然后将柱下端的出水 口关闭，加进5ml（约1/3柱床体积） 20 mmol/L Tris-HCl、 pH7.3的缓冲液，然后将处理好的DEAE—Sepharose Fast Flow， 轻轻搅匀（注意不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态）沿 玻棒靠近柱管壁慢慢连续加进柱内。注意不能带进气泡，待凝 胶沉积约1-2cm后松开层析柱出口，控制流速 0.8ml～1ml/min； 待柱内DEAE —Sepharose Fast Flow 凝胶自然沉降至所需高度 并分出水层后，吸去水层，用玻棒将沉降界面搅匀，再加入处 理好的DEAE—Sepharose Fast Flow凝胶加至距层析柱上端约 3cm处为止（这时须保持DEAE—Sepharose Fast Flow凝胶柱面 平整）。用20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液连通层析柱， 进行柱平衡，直到流出液与缓冲液的pH一致。
7、蔗糖酶活力检测
空白对照 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 5%蔗糖溶液 蒸馏水 分离纯化样品溶液 3.5－二硝基水杨酸试剂 蒸馏水 观察颜色 0.5ml 0.5ml 1.0ml / 1.0ml 5ml 样品管 0.5ml 0.5ml 0.8ml 0.2ml 1.0ml 5ml
50℃水浴10min 100℃水浴5min
实验二 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理； 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术； 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 二、实验基本原理 1、离子交换层析 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子交换剂 为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂与水溶液 中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助 离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进 行。这些过程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质 所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当 洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质 的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所 带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。
方法2 一步洗脱法： 方法2、一步洗脱法： 上样后， 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液进行平衡，洗 脱流速为0.8ml～1ml/min，洗去DEAE－Sepharose Fast Flow未 吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基 线稳定。用0.15mol/LNaCl 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液 继续洗脱被吸附的蔗糖酶蛋白，洗脱流速为0.8ml～1ml/min， 每4ml接一管，直至待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的 基线稳定。测定各接收管的酶活力，将酶活力高的若干管酶液 集中，量出总体积（ml数）（样品Ⅳ），并留样用于测定酶活 力和蛋白质含量测定、电泳分析以及用于“用正交法测定几种 因素对蔗糖酶活性的影响”（限定性设计）实验，样品低温－ 20℃保存。
纯化检测仪器连接示意图
部分收集器 层析柱（φ1.0×20㎝ ） 2 1 DEAE- Sepharose Fast Flow 梯度混合器 恒流泵 核酸蛋白检测仪 记录仪
Tris-HCl，pH7.3缓冲液 1、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液 2、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，（ 1mol/L NaCl） pH7.3缓冲液 Tris-HCl，（ NaCl） pH7.3缓冲液
五、实验操作方法和步骤 1、离子交换剂准备： 离子交换剂准备： 准备 DEAE—Sephadex， 取适量DEAE—Sephadex，加入0.5mol/L NaOH溶液，轻轻搅拌，浸泡0.5小时，用玻璃砂漏斗抽滤，并用 去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加 50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡0.5小时，同上，用去离子水洗至 近中性，（DEAE- Sepharose Fast Flow，用后务必回收）。浸 入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液中平衡备用。 DEAE- Sepharose Fast Flow， （ 按说明书处理）
2、样品处理： 样品处理： 将乙醇沉淀样品溶解于7ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲 液；4℃ 10000r/min, 离心10分钟，收集样品上清液（样品Ⅲ） 测量总体积(ml数），留取1ml（样品Ⅲ）用于测酶活力和蛋白质 含量以及用于电泳分析，将其余样品（样品Ⅲ）作离子交换柱层 析进一步分离纯化蔗糖酶(可先做酶活性检测，取50ul酶液）。 3、纯化检测仪器连接： 纯化检测仪器连接： 将梯度混合器(100ml梯度杯)，层析柱（φ1.0×20㎝ ），恒 流泵（流速0.8～1ml/min），核酸蛋白检测仪（灵敏度0.2A）， 记录仪（纸速：0.5mm/min，50mV）、部分收集器（4ml/管）等 按下图连接并设置好。
离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。 基质 电荷基团 反离子 ＋
可逆交换
阳离子交换剂
基质
— 电荷基团
＋ 反离子
＋
溶液中的离子 或离子化合物
可逆交换
阴离子交换剂
基质
＋ 电荷基团
—
—
—
溶液中的离子 或离子化合物
反离子
2、酶活性检测 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26）， 是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键 裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。同时，每水解1mol 蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，如采 用3.5－二硝基水杨酸法，其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原 糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的 量和反应液的颜色深度成正比。 本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样 品采用3.5－二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多 少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。
5、加样： 加样： 停止加入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。待缓冲液液 面与胶体表面相切时，恒流泵停止工作。用胶头滴管缓慢将样 品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能 保持胶面平整。打开恒流泵，使样品溶液进入胶体，用洗脱缓 冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下。
6、洗脱： 洗脱： 方法1——梯度洗脱法： 方法1——梯度洗脱法： 梯度洗脱法 上样后，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液进行平衡， 洗脱流速为0.8ml～1ml/min，洗去未被DEAE —Sepharose Fast Flow凝胶吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上 绘出的基线稳定，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液NaCl梯 度洗脱（浓度为0-1mol/L NaCl ），层析柱联上梯度混合器， 混合器中分别为50ml 0.05mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液和50ml 含1mol/L NaCl的0.05ml/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。洗脱流速 为0.8ml/min～1ml/min，每4ml接一管，洗脱至缓冲溶液流完为 止。测定各管的酶活力，将酶活力高的若干管酶液集中，测量 总体积（ml数）（样品Ⅳ），并留样用于测定酶活力和蛋白质 含量测定、电泳分析以及用于“用正交法测定几种因素对蔗糖 酶活性的影响”（半自主性设计）实验，样品低温－20℃保存。
四、实验器材与仪器 1、高速冷冻离心机； 2、层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）； 3、恒流泵（流速0.8～1ml/min）（1台/组）； 4、梯度混合器(100ml梯度杯)（1套/组）； 5、核酸蛋白检测仪（灵敏度0.2A）（1台/组） ； 6、记录仪（纸速：0.5mm/min，50mV）（1台/组） ； 7、部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组） ； 8、铁架台、夹子 （固定层析柱用）（1套/组） ； 9、－20℃冰箱（保存样品用）。 10、微量移液枪 200ul、1000ul； 11、1.5ml离心管（留样品Ⅲ用）； 12、7ml离心管（留样品Ⅳ用） ； 13、恒温水浴（100℃）； 14、试管、移液管、试管架等。
值
日
2008.9.17. 甲－3班 班