• 2. 8层纱布过滤，滤液经4℃ 3000 g 离心 10 min, 去除核 和杂质。
• 3.上清液用4 ℃10000 g 离心10 min，沉淀为线粒体。 • 4. 沉淀用 2 ml 0.25 M蔗糖-提取缓冲液重悬，同上离心一
次(4 ℃10000 g 离心10 min)。 • 5.沉淀存于200 μl 0.3M甘露醇中。 • 6.取分离的线粒体滴在载玻片上，滴加 1%詹纳斯绿B溶液
破碎的完整细胞
取上清
3000 rpm 5 min
研磨，过滤 15 ml 0.35 M氯化钠-buffer 两次离心
1 ml
沉淀悬浮
0.35 M氯化钠-buffer
光
叶绿体
学 显
微
镜
玉米黄化幼苗线粒体的分离
• 1.玉米幼苗约5克，加三倍体积（约8 ml）0.25 M蔗糖-提 取缓冲液，在预冷的研钵内快速研磨成匀浆。
实验步骤. 菠菜叶绿体的分离
• 1. 选取新鲜的菠菜嫩叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称3 g置于研钵中，加入 15 ml 0.35 M氯化钠－提取缓冲溶液。
• 2. 研磨成匀浆。 • 3. 用6层纱布过滤,滤液盛于烧杯中。
• 4. 取滤液12ml在1000 r/min下离心 2 min，弃去沉淀。 • 5. 将上清液在3000 r/min下离心 5 min，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。 • 6. 沉淀用1 ml 0.35 M氯化钠－提取缓冲液悬浮。
• 2. 对分离得到的叶绿体及线粒体进行观察 及活性鉴定。
1.差速离心
实验原理
▪ 匀浆、超声、研磨使细胞膜破裂，释放各种细胞器
▪ 在一定的离心力下，不同细胞器的沉降速度不同。
▪ 用不同的离心力，将各种不同亚细胞组分分离。
• 细胞核/叶绿体、线粒体/溶酶体/过氧化物酶体、微体、核糖体等。
由于细胞核与叶绿体的沉降速度相近，二者通过离心的方法较难分离。
• 7.取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧 光显微镜观察时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶 橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片。
菠菜叶绿体的分离实验流程图
洗净、剪碎
3 g菠菜
第一步低速离心： 去除其中的组织
残渣和一些未被1000 rpm 2 min
实验材料
（一）器材： 普通离心机,研钵,天平, 载玻片,盖玻片,滤纸,试管, 试管架,移液管, 滴管, 烧杯,离心管
（二）材料： 菠菜叶片,玉米黄化苗
（三）试剂： ▪ 提取缓冲液：2 mM Na2-EDTA ; 50 mM 三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸
缓冲液(pH7.4), 0.5% BSA (用前加入) ▪ 0.35 M绿B(Janus green B)染液 ▪ 0.3 M甘露醇溶液
实验三
叶绿体和线粒体的分离与观察
商建秀
实验师：刘伟 助教：陈连阁
分离叶绿体和线粒体的意义
1.分离和制备有活性的离体叶绿体是研究叶绿体的结构功能、 光合作用原理及遗传控制机理的前提。 2.对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
实验目的
• 1. 掌握差速离心技术分离细胞器的一般原 理和方法。
染色10分钟后,用光学显微镜观察。
玉米黄化幼苗线粒体的分离实验流程图
5g+ 8 ml 0.25M 蔗糖-buffer
玉米黄化幼苗剪碎、研磨，过滤
4度
分成小管离心 3000g 10min
取上清离心
10000g 10min
沉淀悬浮离心 10000g 10min
沉淀悬浮
200 μl 0.3M 甘露醇
詹纳斯绿B溶液染色,观察
注意事项
• 4人/ 组 2人/叶绿体，2人/线粒体 • 注意：离心机的平衡! • 请用天平平衡！
小型常温离心机 小型冷冻离心机
小型常温离心机 小型冷冻离心机
取新鲜叶片，从叶片的下表面撕取表皮制成装片，在普通显微镜及荧光显 微镜下分别观察气孔及气孔周围的叶绿体。
？？？线粒体詹纳斯绿B染色
如何区别线粒体?
Rcf(g）=1.118 X 10-5 X R（转子半径cm）X N 2 （转速rpm）
渗透压
• 恰好能够阻止水分子通过半透膜从浓度较 低的溶液移向浓度较高的溶液的在较高浓 度溶液的液面上施加的额外压强称为渗透 压。
渗透压
• 溶液渗透压，简单的说，是指溶液中溶质微粒对水的吸引力。溶 液渗透压的大小取决于单位体积溶液中溶质微粒的数目：溶质微 粒越多，即溶液浓度越高，对水的吸引力越大，溶液渗透压越高； 反过来，溶质微粒越少，即与无机盐、蛋白质的含量有关。在组 成细胞外液的各种无机盐离子中，含量上占有明显优势的是Na+ 和Cl-，细胞外液渗透压的90%以上来源于Na+和Cl-。在37℃时， 人的血浆渗透压约为770kPa，相当于细胞内液的渗透压。
2.细胞器的分离介质和条件
• 采用缓冲溶液, 接近细胞质的分散相,保持细胞器 的结构和酶的活性；
• 叶绿体用0.35 M氯化钠或0.4 M蔗糖溶液； • 线粒体用0.25 M蔗糖溶液； • 整个操作过程样品要保持在0℃-4℃,避免酶失活。
3.对分离的细胞器进行鉴定
• 叶绿体用0.01% 吖啶橙荧光染料 • 线粒体用1%詹纳斯绿B染液鉴定活性和纯度。
结果：
结果与讨论
• 1. 绘图并描述光镜下分离的叶绿体的形态及菠菜 下表皮中叶绿体的形态。
• 2. 描述提取到的线粒体的形状及染色情况（如实 验结果不理想，分析造成实验失败的原因。）
思考题
1.植物中分离纯化的叶绿素的酒精溶液在透射光 下为翠绿色，而在反射光下为棕红色。植物中分 离出的叶绿体是否也有同样的现象？请从叶绿体 的功能的角度解释为什么。 2.在细胞器分级分离的实验中，叶绿体分离所用 的等渗溶液势0.4 M的蔗糖，而分离线粒体却用 0.25 M的蔗糖，请从两种细胞器功能上的差异解 释为什么用不同浓度的等渗溶液。