实验四黑曲霉发酵生产柠檬酸
【目的要求】
1. 掌握实验室菌种种子生产方法。

2. 掌握柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。

3. 熟悉并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况；
4. 掌握钙盐法提取柠檬酸的原理与方法。

【基本原理】
黑曲霉发酵生产柠檬酸实验中需要大量活化的孢子，其制备是采用麸皮培养基中保藏的黑曲霉孢子，在新的麸皮培养基上于适当的温度下活化并大量繁殖，从而产生大量活化孢子。

黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）转变为丙酮酸；丙酮酸氧化脱羧形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。

黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环不能充分进行，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。

其理论反应式为：C6H12O6+1.5O2→C6H8O7+2H2O
以薯干粉或玉米粉为原料的黑曲霉柠檬酸发酵液，除了含有大量柠檬酸外，还有大量的菌体，少量没有被黑曲霉利用的残糖、蛋白质、脂肪、胶体化合物以及无机盐类等。

柠檬酸提取就是从成分复杂的发酵液中分离提纯获得柠檬酸。

从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法主要有：钙盐-离子交换法、溶剂萃取法、“吸交”法、离子色谱法等。

目前国外生产主要采用钙盐-离子交换法和溶剂萃取法；国内生产主要采用钙盐-离子交换法，“吸交”法和离子色谱法正在推广中。

钙盐法首先采用过滤或超滤除去发酵液中的菌丝体等不溶残渣，然后在澄清过滤液中加入碳酸钙（或氢氧化钙）发生中和反应，生成难溶的柠檬酸钙沉淀，利用在80-90℃下柠檬酸钙的溶解度极低的特性，通过过滤（或离心）将它与可溶性的糖、蛋白、氨基酸、其它有机酸、无机离子等杂质分离开，用80-90℃热水反复洗涤柠檬酸钙，除去残糖和其他可溶性杂质，经过滤（或离心）获得较净的柠檬酸钙，然后在洗净的柠檬酸钙中缓慢地加入稀硫酸进行酸解反应，生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，经过滤（或离心）除去硫酸钙沉淀，获得粗制的柠檬酸。

其主要反应式为：
2C6H8O7·H2O+3CaCO3Ca3（C6H5O7）2·4H2O +3CO2 +H2O
Ca3（C6H5O7）2·4H2O+3H2SO4 +4H2O 2C6H8O7·H2O+3CaSO4·2H2O
【实验用品】
1. 实验主要仪器设备
超净工作台、恒温培养箱、灭菌锅、三角瓶（500mL）
摇床；离心机；分析天平；旋转蒸发器；分光光度计；比色管；容量瓶；滤布；布氏漏斗；滴定管；水浴锅；试管、烧杯、500ml 三角瓶等若干
2. 材料
菌种：黑曲霉（本实验室保存）
培养基：
麸皮培养基。

黑曲霉种子培养基：20%玉米粉糖化过滤液。

发酵培养基：20%葡萄糖溶液与过滤后的玉米糖化过滤液按比例混合。

2. 实验药品
0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，碳酸钙，95%乙醇，浓硫酸；0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，3,5 二硝基水杨酸试剂，葡萄糖；草酸铵结晶紫液(A 液：1％结晶紫95％酒精溶液：B 液：1％草酸铵溶液。

取A液20mL，B 液80mL混合，静置48 小时后使用) 【方法步骤】
一、麸曲的制备
1 麸皮培养基的配置
将麸皮用纱布袋装好，用自来水将麸皮反复揉洗直至洗液澄清，挤去水分至有水感而水不下滴为宜。

将洗净的麸皮装入500ml干净的锥形瓶中，装入量约为锥形瓶体积的1/5，盖好四层纱布，并用牛皮纸包好。

2 培养基灭菌
将装好的麸皮培养基以高压蒸汽灭菌法灭菌，保持121.3℃，灭菌30min。

3 接种
3.1 孢子悬浮液的制备
取保藏黑曲霉菌种，用接种环挑取少许菌落装入含有玻璃球的三角瓶中，加20ml无菌水，盖好塞子震荡数分钟，即得孢子悬浮液。

3.2 种曲的制备
吸取孢子悬浮液5ml接入麸曲培养基中，然后摊开纱布、扎好，并在掌心轻轻拍三角瓶，使孢子和培养基充分混合，于30-32℃下恒温培养1d后，再次拍匀，于35℃下培养，每隔12-24h摇瓶一次，孢子长出后停止摇瓶，这样继续培养3-4d，即成种曲。

二、摇瓶种子制备
1 摇瓶发酵培养基的配置
将玉米粉用80目筛子筛好备用，称取200g玉米粉于烧杯中，同时加入自来水800ml，即质量比自来水：玉米粉为4:1，混匀。

2 培养基的糖化
将培养基置电热板上搅拌加热，70℃加入淀粉酶2.0g，水解20min，取少量培养基加水稀释后用碘指示剂检验，与淀粉液进行对照，如变蓝表明水解糖化不完全，需补加淀粉酶继续水解至不变蓝，即糖化完全，用双层纱布过滤，即得到20%玉米水解过滤液。

3 分装、灭菌
将配制好的培养基装入摇瓶（锥形瓶）中，装入量为摇瓶总体积的1/10, 2层纱布封口，121.3℃，灭菌15-20min。

4 接种
待培养基温度降至40℃以下时，将活化的黑曲霉孢子（约为4-5片麸皮）接种入培养基中，在33-36℃，200/min的摇床中20h左右，培养后菌体浓度应达60万～150万/ml，菌丝球为致密形的，菌球直径不应超过0.1mm，菌丝短，且粗壮，分支少，瘤状，部分膨胀为优。

三、发酵培养
1 发酵培养基的配置
取20%葡萄糖溶液分别按20：1、10：1、5：1加入玉米糖化液，配成培养基。

2 分装、灭菌
取40ml混合后的培养基加入500ml摇瓶（小于总体积的1/10），2层纱布封口，121.3℃，灭菌15-20min。

3 接种
待培养基温度降至40℃以下，接入发酵种子2ml，24h前于转速100r/min，24h后于转速200-300r/min摇床上，35℃连续培养72h。

将发酵液高温灭活，待处理。

4 发酵过程检测
4.1 pH 值的检测
每隔12 小时检查pH 值。

4.2 黑曲霉菌丝形态的观察
每隔12 小时镜检黑曲霉菌丝的形态变化。

检测方法如下：
4.2.1黑曲霉镜检
方法一：直接取一滴发酵液于载玻片上，用盖玻片密封后镜检。

方法二：镜检过程：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检（染料：草酸铵结晶紫液）。

4.2.2 pH 的跟踪测定：pH 计。

4.2.3柠檬酸总酸的测定
精确吸取5ml 的发酵液过滤液于100ml锥形瓶中，加入少量的去离子水，加2-3 滴0.1%酚酞指示剂，用0.1429mol/L NaOH 溶液滴定，滴定微红色计算用去的NaOH 毫升数，计为柠檬酸的百分含量（每消耗1mlNaOH 1% 的酸度）。

四、钙盐法提取柠檬酸
1. 发酵液过滤各组将发酵液合并量取发酵液总体积，离心或过滤除去菌体及残渣，准确计量取滤液（取5ml滤液，测定柠檬酸含量）。

2. 碳酸钙中和沉淀柠檬酸与碳酸钙发生中和反应，形成难溶的柠檬酸钙沉淀，碳酸钙的添加量根据滤液中柠檬酸的重量添加，比例约为柠檬酸：碳酸钙=2.1：1。

边搅拌边缓慢加入碳酸钙，以防止产生大量气泡。

碳酸钙加完后放置90℃恒温水浴中加热，保温搅拌30分钟，趁热过滤，并用沸水洗涤柠檬酸钙沉淀。

3. 酸解将柠檬酸钙沉淀物取出，称量，加入2倍量的水，调匀，加入浓度为10%的硫酸溶液，硫酸的添加量根据碳酸钙的量计算，碳酸钙与硫酸的摩尔比为1：1.5。

加完硫酸后，搅拌30分钟，过滤，得清亮的棕黄色液体，取样测定柠檬酸的含量，并准确计量柠檬酸液体积。

4. 结晶取柠檬酸液置电热板上加热浓缩，静置析出结晶。

【实验结果】
1. 麸曲外观检查。

2、发酵培养过程中的情况变化
3. 各步提取收率
【注意事项】
1. 麸皮一定要洗净，否则易产生杂菌；
2.用碘液检验淀粉时，要用水稀释。

装入摇瓶的培养基不能太多，否则培养过程中黑曲霉所需要的氧气不充分。

3. 灭菌时注意排除消毒锅内空气，待排气孔无冷凝水滴下即可认为空气排净；
4.进行下一步操作前应用显微镜检测菌球的生长状况，若菌丝细长则说明黑曲霉已经提前进入柠檬酸发酵时期，会导致后期的柠檬酸产量降低。

5. 发酵过程中不能断氧，否则发酵失败。

【思考题】
1、实验室种子制备的原则是什么？
2、柠檬酸的粗提过程中损失的步骤有哪些？
3、从黑曲霉活化至最后进入摇瓶发酵，中间可否省略发酵种子扩大培养这一步？为什么？【实验报告】
1. 姓名、班级、学号、小组编号、试验开始日期/时间。

2. 实验报告包括实验目的、实验原理、实验步骤、注意事项、试验结果、误差分析、思考题等。