IEF:利用等电点差异分离Pr 条件A:样品 SDS-PAGE:利用分子量差异分离Pr 图像分析 差异蛋白质 质谱分析 条件B:样品 确定差异点 数据搜寻蛋 白质鉴定
MAIDI-TOF
数据处理 与生物信 息学分析
ESI-MS/MS
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2DE:Advantages & Disadvantages
• Provides a hard-copy record of separation • Allows facile quantitation • Separation of up to 3000 different proteins • Highly reproducible • Gives info on Mw, pI and post-trans modifications • Inexpensive • Limited pI range (4-8) • Proteins >150 kD not seen in 2D gels • Difficult to see membrane proteins (>30% of all proteins) • Only detects high abundance proteins (top 30% typically) • Time consuming • 30% of spots with multiple proteins from pI 4-7
基本缩略词
IEF: isoelectric focusing (等电聚焦) 2-DE：Two-dimensional gel electrophoresis
第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离； 第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离， 把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开
DIGE：2-D difference Gel Electrophoresis HPLC：High-performance liquid chromatography
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Shotgun:Advantages & Disadvantages
Advantages
• Alleviate some limitations of the 2-DE/MS method • Generally high throughput • Protein identification and quantification is straightforward • process is simple • Can be used to ID posttrans. modifications
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PMF常用软件 Mascot: Profound: PepIdent: www.expasy.ch/tools ProteinProspector: PepSea: 195.41.108.38
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常用串联质谱检索工具
SEQUEST: /sequest
Mascot: PepFrag: ProteinProspector:
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基于2DE的差异蛋白质组分析技术流程
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Shotgun Protein Identification
SCX column fractionation
Reverse column separation
Protein mixture
Protein digests
Auto MS/MS detection
Results BioWorks data base search Tandem MS spectra
Co-separate by 2D PAGE
Excitation wavelength 1
Disadvantages
• Requires more handling for sample isotopic labeling • Low reproducibility • Requires high level expertise • Showed biases for high Mr proteins and against certain types and classes of proteins
优点：与传统两性电解质等电聚焦相比，具有分辨率更高、上样量更大。 分辨率可达0.001pH, 是目前分辨率最高的电泳方法 可用于等电点及其附近的蛋白质和多肽的分析、制备
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pH 梯度范围的选择

使用宽pH范围的胶条（pH 3-10）可以在同一块凝胶上 看到样品中绝大多数的蛋白质。 将有重叠区域的窄pH梯度的胶条联合使用，也同样可 以得到整个pH 3-10范围的结果。
MS是单级质谱，适用于样品不是特别复杂的样品分析。 对于复杂样品，单级质谱会出现很多干扰峰，影响测定。
质谱仪分为进样系统、离子源、质量分析器和检测器四部分。 离子源又分为： 电子轰击源 (Electron Ionization，EI) 化学电离源 (Chemical Ionization，CI) 场致电离源 (FI) 电喷雾电离源 (Electro Spray Ionization，ESI) 等 MS/MS是串联四级杆质谱，通过两个质量分析器间的碰撞室进行 一定能量的碰撞，选择性的扫描碰撞后得到的子离子碎片，不符合 一定质量数的离子被抛弃，这就降低了背景噪音、大大提高了检测的 灵敏度和准确度。 8
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传统的基于2DE的差异蛋白质组学分析技术
优点：
①技术路线成熟 ②重现性和直观性好 ③费用较低 ④展示差异蛋白质的PI和Mw
缺点：
①蛋白质共迁移(comigration)问题，不适合于很复杂的样品
②线性动态范围较窄 ③强疏水性，强硷性，分子量过大(150kD）的 蛋白质受到限制
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基于Shotgun差异蛋白质组分析技术流程
1 mM EDTA, 1 mM EGTA
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2-D Difference Gel Electrophoresis (DIGE)
Protein extract 1 Label with fluor 1 Mix labeled extracts Protein extract 2 Label with fluor 2
基本缩略词
ESI-MS：Electro Spray Ionization-Mass Spectroscopy，
电喷雾质谱
MALDI-TOF-MS：Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization/
Time of Flight Mass Spectrometry 基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱， 是一种新型的软电离生物质谱
ห้องสมุดไป่ตู้
MALDI-TOF-TOF：基质辅助激光解吸离子化-串联飞行时间质谱
MALDI-Q-TOF：基质辅助激光解吸离子化-三级四级杆-飞行时间质谱
LC-ESI-MS/MS: 高效液相色谱-电喷雾串联质谱
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基本缩略词
PMF： Peptide Mass Fingerprinting (肽质量指纹谱)，
是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的
蛋白酶抑制剂 PMSF（很常用，使用 浓度为1mM） 多肽水解蛋白抑制剂， 如： 1. 亮肽素leupeptin 2. 抑肽素pepstatin 3. 抑肽酶aprotinin 4. 苯丁抑制剂bestain 有效抑制的酶 不可逆抑制剂，抑制： 1. 丝氨酸水解酶 2. 一些般胱氨酸水解酶 1. 亮肽素抑制多种丝氨 酸和半胱氨酸蛋白酶 2. 抑肽素抑制天冬氨酸 蛋白酶 3. 抑肽酶抑制许多丝氨 酸蛋白酶 4. 苯丁抑制剂抑制氨基 酸多肽酶 抑制金属蛋白酶 缺点 在含水溶液中很快失活 毒性大 价格昂贵 为小分子多肽，在双向 电泳结果中出现 抑肽素pepstatin在pH 为9 时不能起抑制作用
血浆、血清、体液蛋白质组学 研究及其应用
E-mail: mliu-hncq@ Tel: 6848-5184
1
柳满然 Ph.D
蛋白组学基本知识 血浆、血清蛋白组学
唾液蛋白组学 尿液蛋白组学 脑、脊液蛋白组学
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一、蛋白组学基本知识
3
蛋白质组(proteome = protein + genome): 一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的 全套蛋白质 蛋白质组学（proteomics) 研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化 规律的科学
or high-pressure liquid chromatography (高压液相色谱法)
iTRAQ: Isobaric tag for relative and absolute quantitation 同位素标记相对和绝对定量 7
基本缩略词
MS：Mass Spectroscopy (质谱)


因为绝大多数蛋白聚焦在pH 3-10的中间区域，所以研 究人员有时选用非线性梯度的胶条，这种胶条将两端 的pH梯度压得很窄，却可以使中间区域的蛋白质得到 较好的分离。
将窄 pH 梯度的线性 IPG 胶条重叠使用，效果要比用非 线性胶条好得多，它可以检测出样品中更多的蛋白质 斑点。

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常用蛋白酶抑制剂
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IPG(EF):Immoblized pH gradients isoelectric focusing(固相pH梯度等电聚焦)
建立于20世纪80年代，一种新型等电聚焦技术。利用一系列具有弱酸 或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定，在滴定终点形成pH梯度并参与 丙烯酰胺的共价聚合。
特点：形成固定的、不随环境电场等条件变化的pH梯度
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Sensitivity and dynamic range of protein analysis methods
Sensitivity Bio-Safe coomassie G-250 stain Coomassie Blue R-250 stain Silver stain kit 5-10ng 10-25ng 0.5-1ng