反转录PCR-Reverse transcription PCR．
一种检测底丰度特异ＲＮＡ 的方法
• 互补靶cDNA生成 • 双链靶DNA • 扩增靶DNA
RT－PCR反应体系
• PCR的反应体系－但是模板是RNA • RNA酶抑制剂－RNasin • 反转录酶
禽酶－禽类成髓细胞性白血病病毒(Avian myeloblastosis virus,AMV) 鼠酶－莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)
• 高度敏感： • 理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以 上。 • 应用证实可以将极微量的靶DNA成百万倍 以上地扩增到足够检测分析量的DNA。 • 能从100万个细胞中检出一个靶细胞，或对 诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本 或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样 品中均可检测。
• 快速 • 简便 • 可扩增RNA或cDNA
• PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研 究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制 成功的； • 最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术 应用于β-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞 贫血的产前诊断。 • 使用1976年Chien等分离的热稳定性Taq DNA聚合酶，使PCR操作大为简化，并使 PCR自动化成为可能； • 1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置， 使PCR技术进行实用阶段。
• Taq DNA聚合酶取代了大肠杆菌DNA聚合酶I大片段 使 PCR得到广泛应用。 • Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus （Taq）中分离出的热稳定性DNA聚合酶。 • Taq DNA聚合酶简化了PCR程序,增加了PCR特异性 及PCR扩增效率。该酶的最适温度很高（79℃）， • 100μl反应液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶为佳， • Taq DNA聚合酶保存不当而失活是PCR实验失败的 常见原因。
• • • • 微量的靶基因污染 标本间的交叉污染 样品中存在有靶基因的同源序列 PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、 简化操作程序，使用一次性吸头。
PCR技术的延伸
PCR是一种技术和方法，在使用中不同的人 根据自己的试验目的、结合自己的知识背 景、研究、创造了不同的PCR方法，开拓了 PCR应用的新领域。现在至少有15种不同的 PCR用于不同的试验。
Touch down PCR
• 一般PCR的体系 • 一般PCR的设计原理 • 不同的PCR过程 • 目的：在不知道理想退火温度的条件下保 证扩出产物
梯度PCR
• 在特殊PCR仪上进行的一般PCR • 目的：寻找最佳的退火温度 • 与TouchDown PCR的区别
TD PCR：对同一PCR体系采用不同的退火 温度进行 PCR循 环 梯度PCR：同时对多个PCR体系采用不同的退火温度进行 PCR循环
诊断遗传疾病
PCR的特点
• 特异性高-聚合酶 • 首次报导用大肠杆菌的DNAPolymerase I的 Klenow大片段。90℃会变性失活，需每次 PCR循环都要重新加入；同时引物是在37℃ 延伸 • Taq DNA聚合酶 1988年Saiki等从温泉水中分 离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的， 扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很 低、其错配率一般只有约万分之一
Mg2+
• Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性。 影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链 温度引物二聚体的形成等。 • Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高 时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。 • Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg2+ 。 DNA模 板，引物和dNTP 的磷酸基团均可与Mg2+结 合，降低Mg2+实际浓度。
试剂
• 引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用
不同引物。
• 耐热的DNA聚合酶： • 10×PCR缓冲液500mmol/lKCl;100mmol/L TrisHCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。
• dNTP贮备液 • DNA模板
操作程序
• 试剂混合 • PCR仪程序设计：94℃变性30s，55℃退火20s，然后
• PCR已获得广泛应用,目前，每年都有上千 篇文章发表。 • 1991年，期刊“PCR方法与应用”（PCR Methods and Application）在美国创刊，使 有关学者有了自己的论坛和参考的专业期 刊。 • Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而 获得1993年度诺贝尔化学奖。(一名加拿大籍英国
三磷酸脱氧核苷酸－dNTP
• dNTP是DNA合成的基本原料。 • 含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴 性。 • dNTP浓度过高会导致其错误掺入（即所谓 的“热力背信”）。一般认为最适的dNTP 浓度为50～200μmol/L。 • dNTP的质量也直接影响PCR反应的成败。目的：给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应 条件。 • 目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L Tris-HCl (Tris是 一种双极性离子缓冲液，pH变化于6.8-7.8之间。将Tris浓 度加大到50mmol/L，pH8.9,有时会增加产量。 • 50mmol/L以内的KCl，50 mmol/L以上的KCl则抑制Taq DNA 聚合酶的活性。有些反应液中以NH+4代K+。 • 反应中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml）或明胶（0.01%） 或Tween 20（0.05% ～0.1%） 5mmol/l 的二硫苏糖醇（DTT） 有助于酶的稳定，尤其在扩增长片段（此时延伸时间长） 时。
反向PCR－Reverse PCR
• 一般PCR的引物是相向的，而这里的引物是 反向的。 • 目的：扩增已知序列两端的序列 • 方法：酶切－连接成环
巢（套）式PCR-nested Primer PCR
• 不同的PCR体系－两对引物 • 不同的PCR过程－两段循环 • 目的：增加特异性和灵敏性
复合PCR－Multiplex PCR
• 采用多对引物扩增多条目的片断 • 目的：同时检测多种病原微生物 • 关键问题
不同引物Tm应相差不大 目的片断大小相差不大
PCR技术在医学领域的应用
• 聚合酶链反应或多聚酶链反(Polymerase Chain Reaction, PCR）又称无细胞克隆技术 (“free bacteria”cloning technique) • 特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新 方法。 • 在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至 一个DNA分子扩增107～108倍，大大提高了 DNA的得率。
在72℃延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后， 再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。
PCR反应基本条件及其对PCR的影响
• • • • • 模板核酸 有机溶剂－酚 蛋白质污染 核酸污染 核酸的量
引
物
• 引物与PCR的特异性， • 引物限定扩增产物的大小。
• 合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或 反向高压液相层析（HPLC）纯化。 • 冻干引物于-20℃至少保存12-24个月，液体 状态于-20℃可保存6个月。引物不用时应存 于-20℃保存。
科学家Michael Smith因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法而与 Mullis同享此荣)
PCR技术检测细菌
• 鸭疫里默氏杆菌 • 霍乱弧菌 • 食源性病原细菌 • 结核杆菌
PCR与病毒类疾病应用
• 杂交法检测植物病毒和类病毒 • 利用RT-PCR对黄瓜病毒源种类进行检测 • 诊断人类乳头状病毒HPV感染
温度循环参数
• • • • 变性温度与时间 复性温度与时间 延伸温度与时间 循环数：
PCR实验中常见问题对策
• 假阴性问题 • 假阳性问题。
假阴性
• • • • • Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制 引物设计不合理 提取的模板质量或数量不过关以及 PCR系统欠妥当 循环次数不够
假阳性