2）循环参数
(1)变性 (2) 使双链DNA解链为单链
94℃， 30-60秒 (2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降 低温度可增加反应的灵敏性。
引物设计：
Tm =（G+C）x 4 + （A+T）x 2
（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源
序列。
（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。
（3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
（4）dNTP（10mM or 2.5mM ）
含四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理 后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段
3. 原位杂交检测扩增产物
A.阳性对照
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B.阴性对照
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C.原位检测mRNA表达
荧光定量 PCR（real-time PCR)分析基因表达 水平
通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对 PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合 相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初 始模板量。
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二、实验材料、仪器和试剂
1、材料：含0.3Kb插入片段的克PCR管
琼脂糖凝胶电泳设备
3、试剂：10XPCR 反应缓冲液
25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP
10μmol/L 引物1和引物2
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三、操作步骤
1.反应体系（50µl体系）：
生物化学实验技术
目录
PCR的反应原理 PCR的类型和应用 PCR示例
多聚酶链式反应
（PCR：Polymerase Chain Reaction)
PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种 体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA 快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝 尔化学奖。
Kary B. Mullis
PCR的应用
1、特定DNA片段（基因、调控序列）的鉴定、分离 或制备。
A、DNA
B、cDNA
2、基因表达分析（原位、离体）
A、基因是否表达
B、基因表达水平高低
3、基因突变
基因克隆（ＲＴ－ＰＣＲ）
逆转录酶
mRNA 杂交双链
ＤＮＡ聚合酶
cDNA
PCR扩增
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原位ＰＣＲ分析基因表达的组织特异性
浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低 反应产量
dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA 聚合酶的活性。
（5） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。浓度为0.5-2.5mmol/L。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等 的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
SG
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反向PCR (reverse PCR) 扩增已知序列两侧的未知序 列
用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段， 对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
未知序列
已知序列
未知序列
限制酶 未知序列
已知序列
限制酶 未知序列
连接酶
梯度PCR仪
实时荧光定量PCR仪
普通PCR仪
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模板：DNA
引物：P1 +P2
DNA聚合酶：TaqE
原料：dNTP
反应缓冲液10xBuffer 辅助因子：Mg2+
Taq
Mg2+
P1
dATP dCTP
P2 dTTP dGTP
PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA
结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针
Taqman
Molecular Beacons
Dual Probes(FRET) 引物特异性探针
Amplifluor (Intergen)
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SYBR-Green I
Excitation
SG
5’ 3’
SG SG SG
Emission
3’ 5’
40
20
40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。
PCR反应循环
94℃
变性
55℃
退火
PCR循环
72℃
延伸
引物
5’
3’
3’
5’
变性、退火
延伸
变性、退火
延伸
变性、退火
延伸
PCR的指数扩增（2n）
PCR反应体系
10 X P1
2.5 μL 2.5 μL
25 μL
10 X P2 10X T
2.5 μL 2.5 μL
10 X E 水
2.5 μL 12.5 μL
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3.PCR扩增程序：
94℃
5-10min（预变性）
94 ℃ 55 ℃ 72℃ 72℃ 4℃
30S 30S 30Cycles 30S 5-10min（后延伸） 保温
体内DNA的复制体系
5’ 3’
拓扑异构酶 解旋酶类 SSB
DNA聚合酶（I II III）
引物 dNTP Mg2+
Mullis的PCR构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80 活 性 60
（2）引物长度以15-40 bp为宜。
（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。
（4）引物内部避免形成二级结构。
（5）两引物间避免有互补序列。
（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
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（3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定
（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加
10 X PCR反应缓冲液
25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1 10μmol/L引物2 模板DNA TaqE 补充水
10 X B
10 X P1 P2 10 X T 10 X E
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三、操作步骤
2.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试
剂
并混匀： 10 X Buffer