＝21＋1＝3，这种电子激发态称为三重态(triplet
state)。
能 量
Π*
Π*
Π*
Π
S0 单重基态
Π
S1 单重激发态
Π
T1 三重激发态
分子荧光的产生 （雅布隆斯基分子能级图）
分子荧光的产生 荧光发射：电子由第一激单重态的最低振动能级到基 态，多为S1-S0。由于基态中也有振动弛豫跃迁，这使得发 射荧光的能量比分子吸收的能量要小，所以，荧光的特征 波长比入射波长要长。 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快：109—10-7s，又叫快速荧光或瞬时荧光。外部光源停止照射，
与传统的荧光显微镜相比，使显微成像在Z轴上的空间
分辨率得到了显著改善，大大提高了图像的信噪比和对比度。
全内反射荧光显微成像系统
分子荧光的产生
当一束特定波长的光照射到物质时，物质分子与光量
子发生“碰撞”。如果这次碰撞时有效的：
S2
S1
吸 收
放 热
放 热
荧 光
H
hv
S0
hv
H**
分子荧光的产生
激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大。 荧光：10-7-10-9s 磷光：10-4-100s
光学隧道效应
光强度并不发生全反射,而是有隐失波存于介质2中。 当光疏介质薄膜的厚度小于隐失波的渗透深度时,这个波 不仅穿过了光疏介质,而且会促进邻近高折射率介质3中的 电子作受迫振动,由此产生了新的次波,隐失波的形态发生 了显著改变,全反射被破坏,能量发生了流动,导致了光学 隧道效应的产生。
全内反射荧光显微技术，是利用光发生全内反射时产生 的隐失波照明样本，仅激发样本表面薄层范围内的荧光基团。
隐失波的频率与入射光线的频率相同，其强度随临界 面的垂直距离呈指数衰减：
其中：Z是离开分界面的距离，I(z)表示距离界面Z处 的强度；I(0)表示临界面处的强度。
由于隐失波仅在界面上极薄的一层范围内传播，所以利
用隐失波照明样品，可以仅激发厚度大约 100nm 内的荧光
团，而更深层溶液中的荧光基团不会被激发，因此极大地提 高了显微成像的对比度和信噪比。
荧光马上会消失。 磷光发射：第一激发三重最低振动能级到基态（104—10s），外部光源停止照射后，可以持续一段时间。
全内反射荧光显微镜结构 目前，大多数全内反射荧光显微镜主要有两种基本类
型：棱镜型和物镜型(或无棱镜型)。
棱镜型
全内反射荧光显微镜结构
物镜型使用高数值孔径(NA≥1．4)的物镜作为荧光信号的接受器，
d12是渗透深度，它等于从分界面处到光强衰减 l/e 处的距离。
隐失波强度成指数衰减曲线
隐失波的渗透深度d12是入
射角及相对折射率的函数。 d12是渗透深度,它等于从 分界面处到光强衰减到分界面 处数值l/ e的处的距离。对于
可见光波长而言，浸透深度约
质做的棱镜中间夹一薄层空气层(光疏媒 质)。 如果不断减少空气层的厚度,由于空气层中有透射 波,这透射波进人第二块棱镜。
当成对电子中的一个被激发到 S1、S2等电子能级
激发态时，其自旋不变，即仍和处于基态的另一电
子成对。这些能态都被称为单线态或单重态 (singlet state)。 但如果处于第一电子激发态最低振动能级的电 子 通 过 无 辐 射 跃 迁 （ 系 间 跨 越 ， intersystem crossing) 改变自旋方向，则因消耗部分能量而降至 另一种激发态：S＝1/2＋1/2＝1，多重度 M＝2S＋1
同时又作为发生全内反射的光学器件，样品的放置非常方便，并且可
与多种技术联用，例如纳米操纵、光镊技术、原子力显微镜等。
该系统的关键是高数值孔径物镜的使用。由于细胞的 典型折射率为1．33～1．38，因此要实现全内反射，物镜 的NA必须大于1．38，表达式为： NA = n sinθ n sin θ > n sin θc
其中，NA为物镜的数值孔径 ，n， θ分别为物镜的折 射率(浸没油)和孔径角。θc为发生全内反射时的临界角。
物镜的数值孔径越高，则有更多的孔径范围可被利用，且
容易校准光束。
物镜型全内反射荧光显微镜示意图
全内反射荧光成像基本原理
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)
全内反射荧光显微镜(TIRFM)
目前用于单分子研究的检测技术主要有两大类：扫描 探针显微技术（SPM）和光学技术。其中：
SPM
原子力显微技术（AFM） 扫描隧道显微技术（ STM） 扫描离子电导显微技术（ SICM）
n2
n1
当入射角不断增大，透射角为增大 90°时，入射角达 到临界角 θc。依据 Snell 定律得出：
90º
n2
TIR
n1
当入射角继续增大时，光不再透射进水溶液，即发 生了全内反射。
隐失波
隐失波
90º
n2
TIR
n1
实际上，由于光的波动效应，有一部分光的能量会透过 临界面渗透到水溶液中，平行于界面向水溶液中传播，这一 部分透过的能量场则称之为“隐失波” 或“隐失场”。
生物化学家及药理学家。 1970年他与 卡茨冯奥伊勒共享了诺贝尔生理学和医
学奖。于美国卫生研究院度过其大部职
业生涯。他研究药物及激素的作用、神 经冲动传播的化学方面，并特别研究松
Axelrod,Julius
果体的功能。
光反射和折射示意图
全内反射示意图
光的反射和折射
Snell定律：
Refracted n1>n2 TIR
电子跃迁的单重态（单线态）与三重态（三线态）
在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子 （n, π ）处于不同的自旋状态，通常用多重态M来描述： M＝2S＋1＝1 电子自旋的大小用自旋量子数S表示，S可为+1/2或－ 1/2，这里的正负号取决于自旋的方向。基态中每个能级 通常被两个自旋相反的即自旋配对的电子占据，M=1，成 为单重态。
共聚焦荧光显微技术 （LSCM） 扫描近场光学显微技术 （SNOM） 全内反射荧光显微技术 （TIRFM）
光学显微镜成像 光学技术 光学操纵
发展历程 上世纪80 年代，Axelrod 等生物物理学家对 TIRFM 技 术及基本原理进行描述，并探索了其在生物方面的应用。
阿克塞尔罗德（Axelrod,Julius) 美国