AFLP分子标记实验扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism（AFLP 是在随机扩增多态性（RAPD和限制性片段长度多态性（RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP 分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。
同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。
此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。
其基本原理是：以PCR（聚合酶链式反应为基础,结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。
把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的’接头”用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。
一、实验材料采用青稞叶片提取总DNA实验设备1. 美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统,2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机，3. 美国MJ公司PCR仪,4. 安玛西亚电泳仪等。
三、实验试剂1. 试剂:请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品DNA提取试剂盒；EcoRI酶,Msel酶,T4连接酶试剂盒；Taq 酶,dNTP, PCR reactio n buffer;琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水（18.2M ? • cm2. 其他实验需要物品微量移液枪（一套及相应尺寸Tip头,PCR管，冰浴等。
四、实验流程1、总DNA提取使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。
一般来说，100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。
2、EcoR1酶消化（20ul体系/样品EcoR1 1ul10 buffer 2ul 37 C 65 C 30min 终止反应 sample(总 DNA 5ul ddH 2O 12ul3、 Mse1 酶消化 (20ul 体系 /样品Mse1 2ul (1U/ul10>Buffer 2ulsample(EcoR1 酶切产物 80C 30min 终止反应 ddH 20 1ul4、 T4 DNA Ligase(20ul 体系 /样品T4 DNA Ligase 2ul(1U/ul10>Buffer 2ulsample双酶切产物10ulMse1 Adaptor 1ul 2265C 10min 终止反应 EcoR1 Adaptor 1ul ddH 20 4ul5、预扩增 (20ul 体系 /样品sample 4ulPrimer(Mse1/EcoR1 1ulAFLP Core Mix 15ul* AFLP Core Mix 配方：ddH 20 13.8ulMgCl 2 1.6uldNTPs（2.5mM 1.6ulTaq 酶（1U/ul 1ul10>Buffer 2ul预扩增程序：94°C 2min94 C56 C72 C 2min60 C 30mi n&选择性扩增（20ul体系/样品sample 4ul（预扩增产物稀释 20 倍 Primer（Mse1-XXX/EcoR1-XXX 1ul AFLP Core Mix 15ul选择性扩增程序：94°C 2min94 C 20s66C 30s每循环降1C，共10个循环72C 2min94 C 20s56 C 30s 20个循环72 C 2min60 C 30mi n7、产物电泳检测上样液：Loading Buffer 20ulSize sta ndard-600 0.2ulSample 3ul（稀释 10 倍四、实验结果与分析本实验使用贝克曼库尔特（BeckmanCoulter公司CEQ8000遗传分析系统,运用先进的荧光标记技术和毛细管电泳分离技术进行实验，扩增产物在高分辨率毛细管中电泳分离,采用激光激发荧光采集数据，灵敏度极高，电泳结果通过软件自动统计分析并转换成“0 T矩阵,便于对结果进一步深入分析研究，整个电泳、数据采集和数据分析过程由软件来控制完成，最大程度避免了人工操作造成的误差，提高了数据的可靠性。
产物电泳数据采集在CEQ8000遗传分析系统上进行（图1，得到的数据（图2用第三方软件再进一步统计分析。
图1 AFLP分子指纹图谱*h R«nr hiwM WMoai iimi •笙曲中打订M P KHIIUAW I I加 w^AuriBft dHa r '3* 皆 律it 沪―诗W jp %品■甌■后■何・| VHi ，、F 击心2浮IV 岬*HROH] Fmpwl [4U |SF|«p## UH ||(W*| R M IC A «N | fi«11*丨 F»MI | W ・L HU T ・| WUtu Iv 1 DM J?图2 AFLP “ 0 1”矩阵图AFLP 操作流程图:酶切Msel 酶切 需&辺€口亍——优化数据分析附录1:常用的8对AFLP选择性扩增引物：E-AGG: 5-GACTGCGTACCAATTCAGG -3E-ACG: 5-GACTGCGTACCAATTCACG -3E-AAC: 5-GACTGCGTACCAATTCAAC -3E-ACA: 5-GACTGCGTACCAATTCACA -3E-AGC: 5-GACTGCGTACCAATTCAGC -3E-ACT: 5-GACTGCGTACCAATTCACT -3E-AAG: 5-GACTGCGTACCAATTCAAG -3Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005网站：地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706E-ACC: 5-GACTGCGTACCAATTCACC -3M-CAA: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAA -3 M-CAC: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAC -3 M-CAG: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAG -3 M-CTA: 5- GAT GAG TCC TGA GTA A CTA -3 M-CAT: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAT -3 M-CTC: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTC -3 M-CTG: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTG -3 M-CTT: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTT -3附录2:AFLP 传统垂直板电泳（银染法检测 介绍:原理与方法同前，区别:1.选择性扩增引物不带荧光标记；2.电泳方法不同，采用 测序胶垂直板电泳；3.电泳结果采用银染法，比较直观,但条带的统计与分析全人工 化,工作量大,银染法灵敏度比荧光标记法要低。
示例:下图为玉米（maizeDNA 的AFLP 图谱。
Pan el A: AFLP fin gerpri nts of control maize DNA usi ng EcoRI primer E-AGG with eight Mse1 primers: M-CAA (1, M-CAC (2, M-CAG (3, M-CAT (4, M-CTA (5, M-CTC (6, M-CTG (7, and M-CTT (8.Panel B: AFLP fingerprints of control maize DNA using Mse1 primer M-CAG with eight EcoR1 primers: E-AAC (a, E-AAG (b, E-ACA (c, E-ACT (d, E-ACC (e, E-ACG (f, E-AGC (g, and E-AGG (h.Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005网站: -地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005网站:地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706二ISSR分子标记的实验原理及操作流程ISSR(inter-simple sequenee repeal标记是一种类似 RAPD,但利用包含重复序列并在3'或5'锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。
其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。
用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列，由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5'或3'末端结合，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。
一、实验材料不同来源的DNA(30-50ng/ul。
二、实验设备PCR仪,PCR管或硅化的0.5ml eppendof管，电泳装置,凝胶成像仪。
三、试剂1、ISSR引物:购买成品或根据加拿大 British Columbia大学设计的ISSR引物序列(见附录自己合成。
2、Taq酶3、10xPCR缓冲液4、MgCI 2:25mmol/L。
5、dNTP :2.5mmol/L。
四、操作步骤：1.在25ul反应体系中，加入模板DNA 1ul （30-5Ong ISSR引物1ul （约5pmol 10xPCR Buffer2.5ulMgCl 2 2uldNTP 2ulTaq酶1单位（U 加 ddH20 至 25ul混匀稍离心，加一滴（约20 ul矿物油。
2. 在PCR仪中预变性94C 2分钟,然后循环：94C 1分钟,45C -68C 40秒,72 T 1-2分钟，共40轮循环。
3. 循环结束后,72C 10分钟,4C保存。
4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液（6x于1.6%或1.8%琼脂糖胶上电泳,稳压50-100 V（电压低带型整齐，分辨率高。
5. 电泳结束，溴化乙锭染色20分钟。
6.用凝胶成像仪观察、拍照操作流程简图：地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005网站：地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706注:样品可以采用新鲜样品，硅胶干燥样品，标本等DNA提取可采用CTAB或SDS法DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法附录 UBC Primer Set #9 (Microsatellite引物名称序列引物名称序列801 ATA TAT ATA TAT ATA TT851 GTG TGT GTG TGT GTG TYG 802 ATA TAT ATA TAT ATA TG852 TCT CTC TCT CTC TCT CRA 803 ATA TAT ATA TAT ATA TC853 TCT CTC TCT CTC TCT CRT 804 TAT ATA TAT ATA TAT AA854 TCT CTC TCT CTC TCT CRG 805 TAT ATA TAT ATA TAT AC855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT 806 TAT ATA TAT ATA TAT AG856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA 807 AGA GAG AGA GAG AGA GT857 ACA CAC ACA CAC ACA CYG 808 AGA GAG AGA GAG AGA GC858 TGT GTG TGT GTG TGT GRT 809 AGA GAG AGA GAG AGA GG859 TGT GTG TGT GTG TGT GRC 810 GAG AGA GAG AGA GAG AT860 TGT GTG TGT GTG TGT GRA 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC861 ACC ACC ACC ACC ACC ACC 812 GAG AGA GAG AGA GAG AA862 AGC AGC AGC AGC AGC AGC 813 CTC TCT CTC TCT CTC TT863AGT AGT AGT AGT AGT AGTTel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005网站：地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706814 CTC TCT CTC TCT CTC TA864 ATG ATG ATG ATG ATG ATG815 CTC TCT CTC TCT CTC TG865 CCG CCG CCG CCG CCG CCG 816 CACACA CAC ACA CAC AT866 CTC CTC CTC CTC CTC CTC 817 CAC ACA CACACA CAC AA867 GGC GGC GGC GGC GGC GGC 818 CAC ACA CAC ACA CACAG868 GAA GAA GAA GAA GAA GAA 819 GTG TGT GTG TGT GTG TA869 GTTGTT GTT GTT GTT GTT 820 GTG TGT GTG TGT GTG TC870 TGC TGC TGC TGCTGC TGC 821 GTG TGT GTG TGT GTG TT871 TAT TAT TAT TAT TAT TAT 822TCT CTC TCT CTC TCT CA872 GAT AGA TAG ATA GAT A 823 TCT CTC TCTCTC TCT CC873 GAC AGA CAG ACA GAC A 824 TCT CTC TCT CTC TCT CG874CCC TCC CTC CCT CCC T 825 ACA CAC ACA CAC ACA CT875 CTA GCT AGCTAG CTA G 826 ACA CAC ACA CAC ACA CC876 GAT AGA TAG ACA GAC A827 ACA CAC ACA CAC ACA CG877 TGC ATG CAT GCA TGC A 828 TGT GTGTGT GTG TGT GA878 GGA TGG ATG GAT GGA T 829 TGT GTG TGT GTG TGTGC879 CTT CAC TTC ACT TCA 830 TGT GTG TGT GTG TGT GG880 GGA GAGGAG AGG AGA 831 ATA TAT ATA TAT ATA TYA 881 GGG TGG GGT GGG GTG832 ATA TAT ATA TAT ATA TYC 882 VBV ATA TAT ATA TAT AT 833 ATA TAT ATA TAT ATA TYG 883 BVB TAT ATA TAT ATA TA 834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT 884 HBH AGA GAG AGA GAG AG 835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC 885 BHB GAG AGA GAG AGA GA 836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA 886 VDV CTC TCT CTC TCT CT 837 TAT ATA TAT ATA TAT ART 887 DVD TCT CTC TCT CTC TC 838 TAT ATA TAT ATA TAT ARC 888 BDB CAC ACA CAC ACA CA 839 TAT ATA TAT ATA TAT ARG 889 DBD ACA CAC ACA CAC AC 840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 890 VHV GTG TGT GTG TGT GT 841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC891HVH TGT GTG TGT GTG TGTel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005网站：地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG892TAG ATC TGA TAT CTG AAT TCCC843 CTC TCT CTC TCT CTC TRA 893 NNN NNN NNN NNN NNN 844 CTC TCT CTC TCT CTC TRC 894 TGG TAG CTC TTG ATC ANN NNN845 CTC TCT CTC TCT CTC TRG895AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC846 CAC ACA CAC ACA CAC ART 896 AGG TCG CGG CCG CNN NNN NATG847 CAC ACA CAC ACA CAC ARC 897 CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTGG848 CAC ACA CAC ACA CAC ARG 898 GAT CAA GCT TNN NNN NAT GTGG849 GTG TGT GTG TGT GTG TYA 899 CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCCA850 GTG TGT GTG TGT GTG TYC900ACT TCC CCA CAG GTT AAC ACATel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005网站 :地址:山东省崂山区山东头路 58 号盛和大厦 2-1706三 RAPD 分子标记的实验原理及操作流程RAPD 技术的全称是随机扩增多态性 DNA(Random Amplified PolymorphicDNA,此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物对基因组的 DNA 全部进行 PCR 扩增, 以检测多态性。