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试剂配制

流动相:乙腈-乙酸铵(0.01M,pH5.0)溶液(23:77,v/v)乙腈620mlFra bibliotek甲酸0.19ml
超纯水380ml
充分混合后过滤备用。
四、Western blot试剂
10%SDS:
SDS10g
超纯水100ml
50℃水浴下溶解,室温保存。如在长期保存中出现沉淀,水浴溶化后,仍可使用。
10%过硫酸胺:
超纯水10ml
用0.22μm微孔滤膜滤过灭菌,4℃保存。
不同浓度苯甲胺(BZA)或甲胺(MA)的配制
浓缩液:
10mM BZA
BZA14.3mg
超纯水10ml
用0.22μm微孔滤膜滤过灭菌。
10mM MA
MA6.7mg
超纯水10ml
用0.22μm微孔滤膜滤过灭菌。
工作液:
终体积终浓度
50μl10mMBZA/MA→ 10ml无血清培养基(DMEM/F12)‥‥50μM
10μl1mMH2O2/FA/BZ→5ml无血清培养基(DMEM/F12)‥‥2μM
50μl1mMH2O2/FA/BZ→5ml无血清培养基‥‥‥‥‥‥‥‥‥10μM
100μl1mMH2O2/FA/BZ→5ml无血清培养基‥‥‥‥‥‥‥‥20μM
250μl1mMH2O2/FA/BZ→5ml无血清培养基‥‥‥‥‥‥‥‥50μM
三、高效液相色谱法试剂
0.1M PBS
Na2HPO4·12H2O3.22 g
KH2PO40.136g
超纯水100ml
调pH至7.8
1mM氯吉灵溶液
氯吉灵3.1mg
0.1M PBS10ml
1 mM苯甲胺溶液
苯甲胺1.436mg
0.1M PBS10ml
10 mM二硝基苯肼(DNPH)
DNPH31mg
2N HCl10ml
1mM H2O2
10μl3%过氧化氢原溶液→882μl PBS(终体积)
从中取100μl→1ml PBS(终体积)
1mM FA
45μl37%甲醛原溶液→5ml PBS
从中取25μl→3ml PBS
1mM BZ
11.28mg BZ加2ml超纯水溶解
从中取20μl→1060μl PBS
工作液:
终体积终浓度
5×SDS加样缓冲液
0.5M Tris·HCl(pH 6.8)2.5ml
DTT 0.39g
SDS 0.5g
酚蓝0.025
甘油2.5ml
混匀后,分装,-20℃冻存。
裂解缓冲液[ Tris-HCl (20mM, PH7.2), EDTA (1mM), cocktail (104mMPMSF,0.1mME-64,0.08mMAprotinin,0.1mMLeupeptin)]:
用时稀释100倍。
4%多聚甲醛
多聚甲醛4g
0.01M PBS (无K+)100ml
加热使之溶解,调pH至7.4。
60%缓冲甘油
甘油60ml
加PBS至100ml。
Hoechst 33258
储存液:10mg/ml in H2O
50μg/ml in PBS (pH7.2)
工作液:5μg /ml in PBS (pH7.2)
过硫酸胺0.1g
超纯水1.0ml
溶解后,4℃保存,保存时间为1周。
1.5mol/L Tris·HCl(pH8.8)
Tris (MW121.14) 45.43g
超纯水200ml
溶解后,用浓盐酸调pH至8.8,最后用超纯水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。
0.5mol/L Tris·HCl(pH6.8)
0.5M Tris·HCl(pH 7.6)4ml
100mM EDTA 1ml
100mM DTT 1ml
加超纯水至100ml,混匀后,分装,-20℃冻存。临用时100倍稀释加入cocktail。
分离胶的配制(本论文中选用8%分离胶)
积层胶的配制(本文中用5%积层胶)
五、实验用试剂
1mg/ml LPS
LPS 10mg
附录2:试剂配制
一、细胞培养所需试剂
DMEM/F12培养液制备
(1)准备去离子水;
(2)把干粉加入水中,搅拌使之充分溶解;
(3)加NaHCO31.2g;青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml;
(4)加水至终量;
(5)必要时用1N HCl或1N NaOH调PH至7.2;
(6)用0.22μm微孔滤膜滤过消毒;
(7)分装,使用时按10%量加入胎牛血清。
0.01MPBS
KCl0.20g
KH2PO40.20g
NaCl 8.00g
Na2HPO4·12H2O 2.88g
超纯水(电阻率18.2) 1000ml
调pH至7.3,分装,高压蒸汽消毒法灭菌,4℃保存。
0.25%胰蛋白酶
胰蛋白酶粉末(1:250)250mg
0.01MPBS加至100ml
调pH至7.2,0.22μm微孔滤膜滤过消毒,-20℃保存。
二、免疫组化试剂
0.01MPBS(无K+)
NaH2PO40.30g
NaCl8.50g
Na2HPO4·12H2O 4.00g
超纯水1000ml
0.2% Triton X-100
Triton X-100 10ml
0.01M PBS (无K+)40ml
0.5MTris·HCl(pH7.6)100ml
NaCl8.5g
超纯水1000ml
TBST缓冲液(含0.05%Tween20的TBS缓冲液):
20%Tween201.65ml
TBS 700ml
混匀后使用,现用现配。
封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液)
脱脂奶粉5g
TBST100ml
溶解后4℃保存。使用时,恢复室温,用量以盖过膜面即可,一次性使用。
Tris(MW121.14)5.8g
SDS0.37g
甲醇200ml
超纯水至平面1000ml
溶解后室温保存,此溶液可重复使用3~5次。
10×丽春红染液(2%丽春红S,30%三氯乙酸,30%磺基水杨酸)
丽春红S2g
三氯乙酸30g
磺基水杨酸30g
超纯水至100ml
使用时将其稀释10倍。室温保存。
TBS缓冲液:100mmol/ L Tris·HCl pH7.5,150mmol/L NaCl
100μl10mMBZA/MA→ 10ml无血清培养基‥‥‥‥‥‥‥‥100μM
200μl10mMBZA/MA→ 10ml无血清培养基‥‥‥‥‥‥‥‥200μM
500μl10mMBZA/MA→ 10ml无血清培养基‥‥‥‥‥‥‥‥500μM
不同浓度过氧化氢(H2O2)、甲醛(FA)、苯甲醛(BZ)的配制
Tween2020ml
超纯水至100ml
混匀后4℃保存。
1×电泳缓冲液
Tris (MW121.14) 3.03g
SDS 1g
甘氨酸14.4g
超纯水至1000ml
混匀,室温保存。
1×转移缓冲液(48mmol/L Tris,39mmol/L甘氨酸,0.037%SDS,20%甲醇):
甘氨酸(MW75.07)2.9g
Tris (MW121.14) 15.14g
超纯水200ml
溶解后,用浓盐酸调pH至6.8,最后用超纯水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。
30%Acr/Bis
丙稀酰胺(Acr)29.0g
甲叉双丙稀酰胺(Bis) 1g
加超纯水至100ml,37℃下溶解后,4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
20%Tween20
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