河南科技学院2010届本科毕业论文（设计）一起猪源性大肠杆菌病的诊治学生姓名：**所在院（系）：动物科学学院所学专业：动植物检疫导师姓名：王宪文完成时间：2014年5月一起猪源性大肠杆菌病的诊治摘要大肠杆菌病是由病原大肠埃希氏菌所引起的一种急性、多型性、肠道型传染病，严重影响仔猪的存活率。
主要临床表现有仔猪黄痢、仔猪白痢、猪水肿病。
为了弄清养猪场大肠杆菌病的主要血清型、抗药性等特点，以便采取合理的防治措施，采集病料60份，进行大肠杆菌病的分离培养鉴定、生化试验、耐药性试验等，大肠杆菌的分离鉴定包括病原菌的分离培养、生化试验、毒理试验，在伊红美蓝上挑出略带金属光泽、紫黑色的菌落接种在麦康凯上经过培养后，轻摇显云雾状的菌环，在营养琼脂上培养形成菌落，进行试验找出菌落的特性，以及致病力。
耐药性实验结果表明（），治疗试验中------，试验结论--。
（方法为培养基的制备、琼脂纸片扩散法，氟哌酸、磺胺、四环素对大肠杆菌不太有效，大肠杆菌对头孢类药物较为敏感，对卡那霉素、庆大霉素不敏感）（删除）关键词：仔猪、大肠杆菌、分离鉴定、药敏试验、中草药制剂AbstractEscherichia coli disease is an acute, polymorphism, intestinal infectious diseasescaused by pathogenic Escherichia coli, seriously affect the survival rate of piglets. The main clinical manifestations of yellow scour of newborn piglets, white scour of piglets, edema disease of swine. In order to understand the swinecolibacillosis serotype, drug resistance, in order to take reasonable measures of prevention and cure disease, collecting material is 60, separation of Escherichia coli culture identification, biochemical test, resistance test, isolation, isolation and identification of pathogenic bacteria Escherichia coli include biochemical test,toxicity test, in eosin methylene blue was inoculated with metallic luster, pick out the purple black at mark Kang Kai. After training, annulus rocked the explicitcloud like, culture form colonies on nutrient agar, find out the characteristics ofcolony, and pathogenicity. Methods drug sensitivity test for the preparation of culture medium, agar disk diffusion method, norfloxacin, tetracycline andsulfonamide, less effective against Escherichia coli, E. coli sensitive tocephalosporins, not sensitive to kanamycin, gentamicin,Key words: Piglet, Escherichia coli, isolation and identification, drug sensitive test, micro ecological preparation目录前言 (1)1 材料与方法 (2)1.1 材料 (2)1.1.1 病料 (2)1.1.2 培养基 (2)1.1.3 试验仪器 (2)1.1.4 试验动物 (2)1.1.4 其他材料 (2)1.2试验方法 (2)1.2.1 细菌分离培养 (2)1.2.2 染色镜检 (2)1.2.3 生化试验 (2)1.2.4 增菌纯培养 (2)1.2.5 动物攻毒试验 (2)1.2.6 血清学鉴定 (3)1.2.7 药敏试验 (3)1.2.8 治疗试验 (3)2结果与分析 (4)2.1细菌分离培养 (4)2.2染色镜检 (4)2.3生化试验 (4)2.4 增菌纯培养 (4)2.5 动物攻毒试验 (4)2.6 血清学鉴定 (5)2.7 药敏试验 (5)2.8治疗试验 (6)3 讨论 (7)4 结论 (9)参考文献 (9)前言大肠杆菌是革兰氏阴性菌，繁多的种类，大多数是非致病性的共生菌，是人和动物肠道的正常寄居菌，是构成肠道正常菌群的主要组成部分，一些特殊的血清型具有致病性，易使人和物产生疾病，致病性大肠杆菌分为五大群：肠毒素大肠杆菌、志贺毒素大肠杆菌、败血性大肠杆菌、肠道致病性大肠杆菌、尿道致病性大肠杆菌[1]。
比如腹泻、泌尿道的感染、肺炎新生儿脑膜炎、心内膜炎、以及家禽的卵黄性腹膜炎、猪黄白痢、水肿等疾病。
大肠杆菌是条件性病原微生物，动物体抵抗力下降，在应激条件下，细菌的致病性可表现出来，感染猪发病，造成猪大批死亡或发育不良，成为发展养猪业的重大障碍之一。
有大肠杆菌引起的猪大肠杆菌病由于猪生长期和发病的血清型不同由此引发的疾病分为:仔猪黄痢、仔猪白痢以及猪水肿三种。
自从青霉素被发现以来，抗菌药物的研究和使用得到了长足的发展。
因此有人断言：随着更多的抗生素的相继问世，困扰人类和动物的细菌感染将一去不复返。
现在社会中存在广谱抗菌药的滥用、耐药基因的转移和其他原因造成的耐药性，给人类产生了新的难题。
现在摆在我们面前的不是通过广谱抗菌药的滥用使细菌消失，而是各种耐药病菌的死灰复燃[2]。
研究细菌耐药性和新的抗菌手段这个话题是长期甚至是永恒的。
当今耐药性和严重传染病已经被放在同一位置被讨论。
仔猪黄痢又称早发性大肠杆菌病，1～7日龄仔猪易发，主要临床症状有剧烈腹泻，排黄水样稀便，死亡率高，剖检尸体常脱水严重，皮下常有水肿，肠道膨胀，肠粘膜呈急性卡他性炎症变化，以十二指肠最为严重[3]。
平顶山市新希望养猪场是一个中型养殖场，采用封闭式管理模式。
于2014年3月初饲养一批乳猪，3日龄时突发性腹泻，食欲减退，粪便稀薄且呈黄色，有死亡现象出现，7日龄时死亡率已经达到78%。
最近几年，伴随着养猪业的发展与进步，一部分大肠杆菌性疾病却日益严重比如猪白痢、黄痢，使整个养猪行业经济损失非常严重。
大肠杆菌是一种易产生耐药性的细菌，整个行业滥用抗生素现象严重，再用一般的方法对病猪治疗效果上会大打折扣。
因此通过用分离鉴定的方法找出致病菌，通过药敏试验使用特定的药物，对症治疗才能收到理想的效果。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病料病料来源于平顶山市新希望养殖场，发病乳猪30头，死亡乳猪30只，无菌操作，剖检分别采集乳猪肠内容物、心、肝等病料，共采集60份病料，冷冻保存。
1.1.2 培养基肉汤培养基、营养琼脂培养基按常规方法配制[4]。
麦康凯培养基、伊红美蓝培养基由上海生物制品有限公司生产，按说明说使用。
1.1.3 试验仪器普通光学显微镜；葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、乳糖、甘露醇、肌醇、枸橼酸盐、蛋白栋、磷酸盐蛋白栋水、尿素酶、硫化氢细菌微量生化反应管1.1.4 试验动物30只小白鼠，10只为试验组，10只为肉汤对照组，10只为空白对照组。
30只小鼠均隔离饲养三天，观察小鼠活动情况正常。
40只2日龄健康乳猪，隔离饲养2天，观察乳猪活动情况正常。
1.1.4 其他材料23种大肠杆菌标准单因子血清；药敏纸片；头孢噻肟等药物1.2 试验方法1.2.1 细菌分离培养无菌操作台中操作，将60份样品分别进行划线接种，分别接种在普通琼脂培养基和伊红美蓝培养基上，在恒温箱中37℃培养24h。
然后从伊红美蓝培养基上挑取可疑菌落划线接种于麦康凯培养基上，在恒温箱中37℃培养24h。
1.2.2 染色镜检挑取麦康凯培养基上的可疑菌落，按革兰氏染色方法[5]，进行染色镜检。
1.2.3 生化试验通过常规方法用接种针挑出麦康凯培养基上的上的可疑菌落，分别接种在各种细菌喂料发酵管中，略微倾斜放置于恒温培养箱中，37℃培养24至48h.1.2.4 增菌纯培养对生化试验鉴定为大肠杆菌的菌种，无菌操作，接种于普通肉汤培养基中，于恒温培养箱中，培养24h，进行增菌培养。
1.2.5 动物攻毒试验取增菌培养得到的纯培养物，用生理盐水进行10倍稀释。
对10只试验组小鼠腹腔注射稀释后的纯培养物，每只1.5ml；肉汤对照组10只小鼠，每只腹腔注射1.5ml肉汤；空白对照组小鼠不做任何处理。
30只小鼠均隔离饲养72h，定期观察并记录小鼠发病和死亡情况。
取发病和死亡小鼠的心脏抹片，革兰氏染色镜检。
1.2.6 血清学鉴定把被检菌株分别接种在普通琼脂和肉汤试管内，恒温培养箱中，37℃培养24h。
培养期间震荡肉汤多次。
用0.5﹪石碳酸生理盐水2～3ml洗下普通琼脂培养物，放置在圆底试管中制成悬液，而后与肉汤培养物一起置于120℃高压2小时以便破坏“k”抗原，制备成高压抗原。
培养物用于玻片凝集，肉汤做试管凝集。
挑取圆底试管中的高压抗原与标准的大肠杆菌单因子血清进行各自的玻片凝集反应。
取0.02ml移液管把高压抗原和单因子血清各取0.02ml置于玻板上，用无菌牙签进行混匀，3～10min内出现凝集现象的为“阳性”，与此同时以标准的血清型菌种的抗原和单因子血清型作比较对照，把高压抗原和百分之零点五石碳酸生理盐水的混合物进行对比，观察是否出现自凝现象。
1.2.7 药敏试验本实验用美国临床实验室标准委员会Nccls的方法做药敏试验[6]。
用一般方法把营养琼脂制成平板，然后把其放在温度为四摄氏度的冰箱储存。
在无菌室中打开营养琼脂盖子，用棉签吸取菌液，对试管进行用力挤压，把无菌棉签中多余的的液体挤出。
在营养琼脂上用棉签进行划线，同样的操作进行两次，把平板旋转六十度，把平板表面均匀涂满。
把各个平板通过棉签反复吸收菌液，分为3个平板，一一作标记。
在无菌室内进行操作，镊子取药敏试纸片根据抗菌的不同按照一定的顺序排列分布在培养皿表面，药敏纸片需与琼脂面全部接触，每十五分钟把药敏纸片翻转过来进行培养，把其放在恒温室中进行培养，恒温培养箱中，37℃培养24h 后，观察记录结果。