河南农业大学本科生毕业论文(设计)题目鸡大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验学院牧医工程学院专业班级2011届动物医学专升本3班学生姓名王张凡指导教师许兰菊(教授)撰写日期：2011年5月10 日鸡大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验王张凡（2011届动物医学专升本3班）摘要：为了对巩义某鸡场疑似鸡大肠杆菌病的鸡群进行确诊，并为有效防治提供依据，本研究利用细菌学检验方法对采集的典型病料进行细菌分离鉴定和细菌药敏试验。
通过细菌分离培养、形态学观察、生化试验、动物试验和血清学试验。
结果表明：该鸡群中分离到的病原菌为鸡大肠杆菌。
动物攻毒试验结果表明：分离的鸡大肠杆菌具有明显的致病作用，雏鸡发病率为100%(5/5)，死亡率达60%(3/5)。
血清学鉴定结果显示，该分离菌血清型为O1。
药敏试验结果表明：该细菌对头孢曲松、头孢唑林、阿米卡星、复方新诺明（磺胺甲恶唑）、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、氨苄西林、米诺环素和庆大霉素均敏感，对阿莫西林和阿奇霉素为中度敏感;但对罗红霉素和四环素耐药。
本研究结果对准确诊断和有效防治该病提供了依据和条件。
关键词：鸡；大肠杆菌；分离鉴定；药敏试验Isolation, Identification and Antibiotic Sensitivity Testof Chicken Escherichia Coliwang zhangfan(Class 3 of Veterinary Medicine, Graduated in 2011)Abstract:In order to make a definite diagnosis for the suspend Chicken Escherichia Coli about chicken house from Gongyi and provide a reference for effective prevention and treatment. The bacteria was isolated and identified from typical samples and antibiotic sensitivity test was also adopted. By bacterial separate cultures, morphological observation, biochemical tests, animal experiment and serological tests, the pathogen of this chickens is pathogenic E.coli bacteria. The result of animal experiment showed: this Escherichia coli had obviously pathogenic; the morbidity of chicklings was 100%(5/5) and the mortality was 60%(3/5).Serological testing results indicated: the serotype of this strain was O1. The antibiotic sensitivity test results illuminated: the sensitivity of the strain to ceftriaxone、cefazolin and other 8 kinds of drug were sensitive; and the drug sensitivity to amoxicillin and azithromycin are intermediate;but the strain were drug resistant to roxithromycin and acheomycin. This research provided a scientific basis and qualification for exact diagnosis and effective prevention and treatment to Escherichia coli.Key word:Chicken,Escherichia Coli, Isolation and Identification, Antibiotic Sensitivity Test鸡大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avian pathgenicity E．coli，APEC)引起的急性或慢性细菌性传染病，各种日龄的鸡均可发病，但雏鸡和产蛋鸡更易发病，其常与其他疾病混合感染加重病情，该病表现不同的病型，常见的病型有急性败血症、气囊炎、腹膜炎、卵巢炎、输卵管炎、脐炎、肉芽肿等[1, 2]。
现有的研究表明，APEC抗原性复杂、血清型多样，不同种类之间和不同地区之间致病菌的血清型差别很大[3, 4]。
鸡大肠杆菌病一年四季均可发生，各品种和各年龄的鸡均可感染，尤其是雏鸡发病率最高，可达55％以上。
若不及时采取有效的防治措施，便会导致大量死亡，病死率可达75％一100％；成鸡一般为慢性或隐性感染[5]。
其造成的生长发育迟缓、生产性能下降、饲料报酬下降、种鸡及产蛋鸡的蛋品品质下降和孵化率的降低、死淘率及屠宰废弃率增加以及药费的增加等，给养殖业造成了极大的经济损失。
本研究对河南省巩义地区鸡群发生的疑似鸡大肠杆菌病进行了临床初步诊断，并采集典型病料进行病原菌的分离鉴定与药敏试验，取得了理想效果，为该病的确切诊断和有效防治提供了可靠依据。
现将有关情况报告如下：1材料与方法1.1试验地点、时间2011年3月1日～4月30日在河南农业大学重点开放实验室工程楼0909室进行本研究。
1.2 病料来源与采集对来自巩义地区的疑似鸡大肠杆菌病的病例进行临床初步诊断，并无菌操作采集典型病料心、肝、脾、十二指肠等。
1.3 实验动物及分组一日龄健康罗曼雏鸡15只，购自于大河遗址孵化场。
将雏鸡按照每组五只随机分为3组，其中攻毒组、空白对照组和普通营养肉汤对照组各一组。
以上三组雏鸡均按正常饲养标准隔离饲养，经过3天观察，各雏鸡均正常，以备攻毒试验。
1.4 主要试剂1.4.1培养基和生化鉴定管制备普通肉汤培养基，营养琼脂培养基，伊红美蓝琼脂培养基，麦康凯琼脂培养基，乳糖发酵管培养基，V-P培养基，MR培养基，以上培养基均按常规方法[6-8]配制。
其所需试剂有：蛋白胨（批号：20100702），牛肉粉（批号：20080712），均由北京奥博星生物技术有限责任公司生产；氯化钠（批号：20110104），由天津市瑞金特化学品有限公司生产；琼脂粉由XinTai in Japan 生产；猪胆盐（批号：20090823），由北京双旋微生物培养基制品厂生产；乳糖（批号：20070308），由天津市北方天医化学试剂厂生产；中性红（批号：2-60-12-15），次甲基蓝（美兰）（批号：4-61-08-20），均由中国公私合营新中化学厂生产；曙红Y（伊红）（批号：F 20011209），由中国医药（上海）化学试剂公司生产；磷酸氢二钾（批号：20050906），由广西汕头市西龙化工厂生产；葡萄糖（批号：20070910），由中国郑州派尼化工试剂厂生产；麦芽糖（批号：19910926），由中科院上海生化所东风生化技术公司生产；甘露醇（批号：20081015），由北京中联化工试剂厂生产；蔗糖（批号：9840220），由北京化工厂生产。
1.4.2 革兰氏染液自制革兰氏染液，按文献要求配制[6]。
1.4.3 药敏纸片阿莫西林（10μg/片，批号：100301），氨苄西林（10μg/片，批号：1009211），头孢唑啉（30μg/片，批号：1009171），头孢曲松(30μg/片，批号：1011031)，罗红霉素(15μg/片，批号：100531)，庆大霉素（10μg/片，批号：1001201），阿米卡星（30μg/片，批号：1010221），米诺环素（30μg/片，批号：1010132），阿奇霉素（15μg /片，批号：101213），磺胺甲噁唑（23.75/1.25μg /片，批号：1009031），四环素（30μg /片，批号：1008311），环丙沙星（5μg/片，批号：100901），诺氟沙星（10μg/片，批号：1009252）和氧氟沙星（5μ1g /片，批号：1009022），均由北京天坛药物生物技术开发公司生产。
以上药敏纸片均购自河南省生物所。
1.4.4 大肠杆菌诊断血清共26种O1(5120*,批号20090416)，O2(10240*,批号200901)，O5 (2560*,批号200605)，O8(2560*,批号200901)，O9(2560*,批号200901)，O11(5120*,批号200904)，O14(640*,批号200211)，O15(5120*,批号200709)，O18(5120*,批号200408)，O19(2560*,批号200709)，O20(2560*,批号200407)，O21(5120*,批号200901)，O24 (640*,批号200709)，O26 (2560*,批号200709)，O35 (5120*,批号200901)，O36 (2560*,批号200505)，O50 (2560*,批号200505)，O54(1280*,批号200709)，O74(1280*,批号200211)，O78(1280*,批号200612)，O88(1280*,批号200901)，O111(10240*,批号200605)，O119(640*,批号200104)，O141 (2560*,批号200901)，O147 (1280*,批号20080327)，O157 (2560*,批号200901)，以上血清均购自中国兽医药品监察所，均在有效期内。
用时按照使用说明书要求进行稀释，4℃保存备用。
1.5 主要仪器.超净工作台（型号：SW-CJ-IC），中日合资苏净集团安泰公司制造；高压蒸馏灭菌器（型号：LDZX-30KBS），上海申安医疗器械厂制造；显微镜（型号：AC220V IN），重庆光电仪器总公司制造；恒温培养箱（型号：PYX-DHS-50 X65-BS-Ⅱ），上海跃进医疗器械厂制造；电子天平（型号：11636920），Made by Sartorius AG制造等。
1.6 分离鉴定方法1.6.1 细菌分离培养用接种环无菌操作从病料中挑取病原菌，并接种于普通营养肉汤中进行增菌培养，然后分别在普通营养琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板划线，于37℃培养24h。