第一章荧光分光光度分析法
1.1概述
1.1.1 基本原理
由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。
物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态,这些处于激发态的分子是不稳定的，在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光。
不同物质由于分子结构的不同，其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时，其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系，即IF=KC，利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析，与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
1.1.2 基本结构
图1 荧光分光光度计工作原理示意图
（1）光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。
（2）激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
（3）发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
（4）样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
（5）检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
可将光信号放大并转为电信号。
1.1.3 仪器操作规程
1.1.3.1 开机
a. 确认所测试样液体或固体，选择相应的附件。
b. 先开启仪器主机电源，预热半小时后启动电脑程序RF-5301PC，仪器自检通过后，即可正常使用。
1.1.3.2 测样
（1）spectrum模式
a. 在“Acquire Mode”中选择“Spectrum”模式。
•对于做荧光光谱的样品，“Configure”中“Parameters”的参数设置如下：“Spectrum Type”中选择Emission；给定EX波长；给定EM的扫描范围(最大范围220nm—900nm)；设定扫描速度；扫描间隔；狭缝宽度，点击“OK”完成参数的设定。
•对于做激发光谱的样品，“Configure”中“Parameters”的参数设置如下：“Spectrum Type”中选择Excitation；给定EM波长；给定EX的扫描范围(最大范围220nm—900nm)；设定扫描速度；扫描间隔；狭缝宽度，点击“OK”，完成参数的设定。
b. 在样品池中放入待测的溶液，点击“Start”，即可开始扫描。
c. 扫描结束后，系统提示保存文件。
可在“Presentation”中选择“Graf” “Radar” “Both Axes Ctrl+R”来调整显示结果范围；在“Manipulate” 中选择“Peak Pick”来标出峰位，最后在“Channel”中进行通道设定。
d. 述操作步骤对固体样品同样适用。
（2）Quantitative模式
a. 在“Acquire Mode”中选择“Quantitative”模式。
b. “Configure”中“Parameters”的参数设置如下：
Method 选择“Multi Point Working Curve” ；“Order of Curve” 中选择“1st和
“No” ；给定EX、EM波长；设定狭缝宽度，点击“OK”，完成参数的设定。
c. 在样品池中放入装有空白溶液的比色皿后执行“Auto Zero” 命令校零点。
d. 点击“Standard”模式，制作工作曲线。
e. 将样品池中的空白溶液换成一系列的已知浓度的样品标准溶液进行测量，执行“Read”命令，得到相应的荧光强度，系统根据测量值自动生成一条“荧光强度-浓度”曲线。
f. 在“Presentation” 中选择“Display Equation”，得到标准方程。
将此工作曲线“Save”为扩展名为“.std”的文件。
g. 工作曲线制备完毕，即可进入未知样的测量，选择进入“Unknown”模式，将样品池中的已知浓度标准溶液换成待测样品溶液，执行“Read”命令，即可得到相应的荧光强度和相应的浓度。
将此“Save”为扩展名为“.qnt”的文件。
（3）Time Course模式
a. 在“Acquire Mode”中选择“Time Course”模式。
b. “Configure”中“Parameters”的参数设置如下：
给定EX、EM波长；设定狭缝宽度；设定反应时间；读取速度；读取点数；
点击“OK”，完成参数的设定。
c. 在样品池中放入装有空白溶液的比色皿后执行“Auto Zero” 命令校零点。
d. 将样品池中的空白溶液换成待测溶液，点击“Start”，即可开始扫描。
扫描结束后，即可得到荧光强度对时间的工作曲线。
e. 将此工作曲线“Save”为扩展名为“.TMC”的文件。
1.1.3.3 关机
退出软件后关毕主机。
1.2实验项目
实验1-1 荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量（验证性实验）【目的要求】
1.学习荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理。
2.掌握荧光光度计的操作技术。
【基本原理与技能】
维生素B2，又叫核黄素，是橘黄色无臭的针状结晶。
维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂。
在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
维生素B2水溶液在430~440nm蓝光或紫外光照射下会发生绿色荧光，荧光峰在535nm，在pH 6~7的溶液中荧光强度最大，在pH 11的碱性溶液中荧光消失。
多维葡萄糖中含有维生素B1，B2，C，D2及葡萄糖均不干扰维生素B2的测定。
由于维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生光分解而转化为光黄素，后者的荧光比核黄素的荧光强的多。
因此，测量维生素B2的荧光时，溶液要控制在酸性范围内，且须在避光条件下进行。
【仪器与试剂】
1.岛津RF-5301PC型荧光分光光度计；
2．10μg/mL维生素B2标准溶液：准确称取10.0mg维生素B2，用热蒸馏水溶解后，转入1L棕色容量瓶中，冷却后加蒸馏水至标线，摇匀，置于暗处保存；3．冰乙酸（AR）；
4．多维葡萄糖粉试样。
【操作步骤】
1.标准曲线的绘制
于6只50mL容量瓶中，分别加入10μg/mL维生素B2标准溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mL，再各加入冰乙酸2.0mL，加水至标线，摇匀。
在970 CRT荧光分光光度计上，用1cm荧光比色皿于激发波长440nm，发射波长540nm 处，测量标准系列溶液的荧光强度。
2．多维葡萄糖粉中维生素B2的测定
准确称取0.15~0.2g多维葡萄糖粉试样，用少量水溶解后转入50mL容量瓶中，加冰乙酸2mL，摇匀。
在相同的测量条件下，测量其荧光强度。
平行测定三次。
【结果处理】
以相对荧光强度为纵坐标，维生素B2的质量为横坐标绘制标准曲线。
从标准曲线上查出待测试液中维生素B2的质量，并计算出多维葡萄糖粉试样中维生素B2的百分含量。
【注意事项】
1.请注意爱护液体比色皿，特别是测试有机样品的同学请在测量完毕后用有机溶剂清洗，干燥后再放入盒子中，否则会造成比色皿表面严重污染，影响透光度。
2. 固体样品池仅剩一个，测试完毕请物归原处。
3. 测试完毕请注意登记，关闭仪器。
【思考与讨论】
1. 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。
2. 维生素B2在pH=6~7时最强，本实验为何在酸性溶液中测定？
【思考与讨论的答案】
1. 答：由于现代电子技术具有检测十分微弱光信号的能力，并且荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度也可以增大荧光强度，使测定的灵敏度提高；而吸收光度法测定的是吸光度，不管是增大入射光强度，还是提高检测器的灵敏度，都会使透射光信号与入射光信号以同样的比例增大，吸光度值不会改变，因此灵敏度不能提高。
2. 答：因为维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比维生素B2的荧光强的多。
因此，测量时溶液要控制在酸性范围内进行。