1、目的
依据GB/T18204.3—2000公共场所茶具微生物检验方法大肠菌群测定，熟练掌握此规程，保证检验结果的准确性。
2、适用范围
本标准规定了公共场所内公用茶具大肠菌群的测定方法。
3、责任
使操作者熟悉本规程，并在具体样品检验中严格遵照操作，确保检测结果准确性。
4、内容：
4.1定义：大肠菌群
指一群在37℃、24h培养能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌痒的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价被检物的卫生质量。
4.2 仪器：
高压蒸汽灭菌器。
干热灭菌箱。
培养箱：36℃±1℃。
冰箱。
电炉。
天平。
灭菌平皿：直径9cm。
灭菌刻度吸管：1mL,10mL。
灭菌棉拭子。
灭菌剪刀。
PH计或精密PH试纸。
4.3 培养基和试剂：
4.3.1乳糖胆盐发酵培养液
4.3.1.1成分：
蛋白胨20g
猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g
乳糖10g
0.04%溴甲酚紫水溶液25ml
蒸馏水1000ml
4.3.1.2制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中，调pH值至7.4，加溴甲酚紫溶液，混匀，分装到带有倒管的试管中，每管10ml，在115℃高压灭菌15分钟。
（注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍）
4.3.2伊红美兰琼脂
4.3.2.1成分：
蛋白胨10g
乳糖10g
磷酸氢二钾2g
琼脂17g
2.0%伊红水溶液20ml
0.65%美蓝溶液10ml
蒸馏水1000ml
4.3.2.2制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，调pH值至7.1，分装到烧瓶内。
121℃高压灭菌15分钟备用，临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美篮溶液，摇匀，倾注平板。
4.3.3乳糖发酵管
4.3.3.1成分：
蛋白胨20g
乳糖10g
0.04%溴甲酚紫水溶液25ml
蒸馏水1000ml
4.3.3.2制法：将蛋白胨和乳糖溶于水中，调pH值至7.4，加入指示剂，分装到带有倒管
的试管中，每管3ml，在115℃高压灭菌15分钟。
4.3.4革兰氏染色液
4.3.4.1结晶紫染色液：
结晶紫1g
95%乙醇20ml
1%草酸铵水溶液80ml
将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
4.3.4.2革兰氏碘液：
碘1g
碘化钾2g
蒸馏水300ml
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。
4.3.4.3脱色液：95%乙醇
4.3.4.4沙黄复染液：
沙黄0.25g
95%乙醇10ml
蒸馏水90ml
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
4.3.5染色法
4.3.
5.1将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色1分钟，水洗。
4.3.
5.2滴加革兰氏碘液，作用1分钟，水洗。
4.3.
5.3滴加95%乙醇脱色，约30秒，水洗。
4.3.
5.4滴加复染液，复染1分钟，水洗，待干，镜检。
4.3.6染色结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
4.3.7大肠菌群快速检验纸片
4.3.7.1质量要求：纸片必须符合食（饮）具用大肠菌群快速检验纸片质量标准。
4.3.7.2质量标准：每张纸片5c m×5cm，pH值7.0～7.4，包装无菌，生产厂家经卫生部门审核认可。
4.4 检验程序：
大肠菌群检验程序如下：
见GB/T 18204.3—2000中第5章。
4.5 操作步骤
4.5.1 采样方法
4.5.1.1 随机法：随机抽取清洗消毒后准备使用的茶具。
4.5.1.2 涂抹法：使用测定细菌总数时采集的样品，无需重采。
4.5.1.3 纸片法：用灭菌生理盐水湿润5cm×5cm大肠菌群快速测定纸片两张，分别贴在茶具内、外缘口唇接触处，约30s后取下，置于无菌塑料袋内。
4.5.2 检验方法
4.5.2.1 发酵法
4.5.2.1.1 用测定细菌总数剩余的检样，倒入双料乳糖胆盐发酵培养液中。
置36℃±1℃培养箱内培养24h。
4.5.2.1.2 观察是否产酸、产气，若有变黄和气体产生，该管推测是检验阳性。
如不产酸、产气则为大肠菌群阴性。
4.5.2.1.3 自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，转种伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃培养箱培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实性试验。
4.5.2.1.4 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行染色镜检；
同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃培养24h。
4.5.3 纸片法
将已采样的纸片置36℃±1℃培养箱内培养16～18 h，观察结果。
4.6 结果报告
4.6.1发酵法
凡乳糖发酵管最终产酸、产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告检出大肠菌群。
4.6.2纸片法
纸片保持紫蓝色不变，则报告为大肠菌群阴性；纸片变黄，并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕，则报告检出大肠菌群。