中国科学 G 辑: 物理学 力学 天文学 2007年 第37卷 增刊: 21~29收稿日期: 2007-05-20; 接受日期: 2007-08-28国家自然科学基金资助项目(批准号: 60532090, 60627003, 60408011) * E-mail: hbniu@《中国科学》杂志社SCIENCE IN CHINA PRESS 细胞生命现象分析和研究的光学方法与手段牛憨笨* 袁小聪 屈军乐 许改霞 刘立新 彭 翔(深圳大学光电工程学院, 光电子学研究所, 光电子器件与系统教育部重点实验室, 深圳 518060) 摘要 未来生物学发展的一个重要方向是系统生物学研究, 其根本目的是从系统角度深入理解包括细胞增殖、分化、凋亡在内的重大生命过程. 系统生物学研究的基本内容是高通量获取从一维的基因到多维的蛋白质信息, 并通过系统整合所获得的信息而最终重构出细胞生命如何建立、执行或取消一种生物功能的基本图像, 其中蛋白质信息包括蛋白质的数量和空间分布、蛋白质之间的相互作用、蛋白质在细胞生命活动中发生的变化等. 随着基因组时代的基本结束, 研究者已经开始从原来关注静态的“密码”转向了研究动态的“功能”. 这将要求来自物理或化学的新技术应用到生物学以收集细胞动态信息. 需要在活细胞水平上进行的研究至少包括两类: 一类是对活细胞群体进行快速无损的功能检测, 主要服务于临床快速诊断、药物筛选和某些细胞功能分析; 另一类则是针对单细胞进行的亚细胞结构和大分子的动态功能表征分析. 光学技术是研究活细胞功能的主流研究方法, 具有无损、高特异性、高灵敏、高空间分辨、高时间分辨和实时动态等优势.主要介绍用于活细胞功能分析的光学方法与手段及其发展现状与趋势.关键词 光学方法 功能成像 光学散射力 细胞生命现象20世纪中期以来, 随着DNA 双螺旋结构和蛋白质空间构象的发现, 生命科学已成为自然科学中最重要的学科. 回顾历史, 我们不难发现, 生命科学的发展是与相关的技术科学的发展是相辅相成的. 每一次生命科学的大发展都是技术进步推动的结果, 而生命科学的大发展又进一步牵引了相关技术的进步(Nobel lecture: /medicine/laureates/2002/index. html).在现代生命科学研究中, 相关的技术和仪器可以分为两大类: 一类是以生物学原理为主设计的, 例如聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术、基因芯片和蛋白质芯片等; 另一类则是基于物理、化学原理的仪器, 如X 射线衍射仪、光学显微镜、质谱仪和电子显微镜22中国科学G辑物理学力学天文学第37卷等. 从目前的发展趋势看, 现代生命科学的发展越来越依赖于高新技术. 可以说, 在“后基因组时代”, 谁拥有更加先进的技术, 谁就是生命科学研究的“领头羊”. 正因为如此, 第224次香山科学会议上提出的战略思想是: 1)在生命科学的基本问题上下功夫; 2)改进或创造基本技术, 因为没有技术的改进创新, 单单依靠现有商品化的仪器设备, 很难设想我们能比别人做出更多、更高的创新性工作.当然, 要发展生命科学研究中所需的新方法和新手段, 首先要深入了解生命科学目前的发展现状、重点要解决的科学问题和发展趋势. 20世纪中叶以来, 人们通过应用X射线衍射仪解析了DNA的双螺旋结构和蛋白质的空间构象之后, 科学家的研究视野已经逐步从一两个基因或蛋白质的行为扩展到了成千上万个基因或蛋白质的表现. 此外, 由于复杂系统理论和非线性科学的发展, 人们关注的对象已不再停留于一条代谢途径或信号转导通路, 而是拓展提升到了决定细胞各种功能动态网络结构和生物大分子之间的相互作用关系. 今天, 人们对基因组和蛋白质组的研究已经将生物学研究提升到了系统生物学的高度. 一方面, 基因组学(genomics)奠定了系统理解细胞生命活动的分子生物学基础, 并准备了充分的信息学方法. 另一方面, 蛋白质组学(proteomics)则进一步从更加宏观的角度来理解在细胞生命活动中, 蛋白质的组成与相互作用所构建的蛋白质分子网络. 然而, 从系统生物学角度来看, 对于理解一种生物学功能或过程的本质, 研究者需要在细胞、组织、器官和生物体整体水平研究结构和功能各异的各种分子及其相互作用, 这是一个逐步整合的复杂过程, 可能需要一个世纪或更长时间才能完成. 因此, 为了实现从生命密码到生命现象、生命过程的研究, 首先必须从细胞的生命现象和生命过程研究着手, 需要了解细胞内蛋白质具体的组成、含量、修饰、定位、动态传输、交互作用以及这些现象与细胞整体功能的关系. 实际上, 生命科学研究的维度是趋向于更加丰富的. 为了解细胞的生命活动, 高通量获取并整合从一维的基因表达到多维的蛋白质的数量、空间分布以及修饰在细胞的动态生命活动过程中发生的变化信息, 最终重构出细胞完成一种独立生物学功能的根本机制, 从而更深刻地理解细胞的增殖、变异和凋亡等生命过程. 在这些研究中我们需要了解:(ⅰ) 如何在高效、高通量、无损伤的情况下实现活细胞内大分子成分(比如蛋白质, 目前只能依靠抗体识别, 用荧光或酶标记后靠显微镜观察)的特异性表征;(ⅱ) 如何测量活细胞的机械特性和电学特性, 并进一步利用这些新的特性作为疾病检测和诊断的新指标;(ⅲ) 如何针对分子和亚细胞结构进行实时动态检测以及如何测量不同蛋白质在细胞内微环境的差异分布等.然而, 目前的组学研究手段多基于分子生物学、生物化学与化学生物学, 这些方法操作复杂, 且功能单一. 更为突出的问题是, 这些方法都需要离体操作, 即都要将细胞破碎、纯化、富集或扩增目标分子, 不能实现活细胞实时定位测量. 而光学方法在这方面却具有独特的优势.光学技术是研究活细胞生命现象的主流研究方法, 具有无损、高特异性、高灵敏、高空间分辨、高时间分辨和实时动态等优势[1]. 20世纪60年代激光发明之后, 光学为生命科学的发展提供了许多新方法和新手段, 其中包括近场光学显微技术、共焦显微技术和光学相干层析成像技术等. 它们从不同的工作原理出发分别为生物学研究提供了超衍射极限的空间分辨图像和显微层析结构图像. 更为重要的是, 近年来利用激光技术发展了包括荧光多参量和Raman显微增 刊牛憨笨等: 细胞生命现象分析和研究的光学方法与手段23成像技术. 它们和上述各种显微成像技术的显著不同之处是可以提供揭示生物分子组分和构象的功能图像, 或可以提供表示不同物质之间相互作用的功能图像, 而不是纯粹的微观结构图像. 显然, 这是研究细胞组学所亟需的方法和手段. 值得关注的另一个进展是探测器的时间分辨率在不断获得改进, 这对研究活细胞内的各种微观动态过程具有十分重大的意义. 借助该技术, 我们不仅可获得活细胞内随时间变化现象的某一瞬态的清晰图像, 还可获得现象随时间连续变化的“电影”. 另外, 激光技术还与微光学技术相结合实现了对细胞的可控操纵和可控变形, 发展成可灵活操作细胞的光镊和光涡流等, 从而为实现细胞的固定、筛分、弹性测量、模拟细胞在生理和病理条件下所受到力的影响等创造了条件. 介绍用于活细胞现象分析和研究的光学方法和手段的发展现状及未来发展展望.1国内外发展现状目前需要在活细胞水平进行研究的有两类问题: 一类是对群体活细胞进行快速无损的功能检测, 主要解决临床快速诊断、药物筛选和细胞功能分析, 这方面的研究把生物学和基础医学带入细胞组学研究时代; 另一类是针对单细胞进行亚细胞结构和分子水平的动态功能分析, 主要用于细胞生物学和相关学科对细胞内基本功能的解读. 这两类问题的研究不是截然分开的, 对单细胞内基本功能的了解有利于群体活细胞功能的进一步分析.为开展上述研究, 需要发展的光学新方法和新手段应具有如下特征:(ⅰ) 与活细胞等生命体环境友好, 输入光不会损伤活细胞, 不会扰动其正常活动;(ⅱ) 能提供细胞和亚细胞结构研究的超衍射极限的空间分辨率;(ⅲ) 能提供细胞和亚细胞结构各种生命现象的动态过程研究的高时间分辨率;(ⅳ) 能提供细胞成分、构象及细胞内不同生物分子之间相互作用的功能信息;(ⅴ) 能实现细胞的可控操纵和可控变形;(ⅵ) 能实现活细胞无损、无扰动参量检测.具有上述特征的光学新方法和新手段, 将使细胞组学研究所需进行的活细胞光学微操纵、筛分、可塑性测量、表面成像、体成像、功能成像、光谱分析等成为可能.近年来, 围绕上述问题的解决已取得许多研究成果. 下面就有关进展分述如下:1.1应用于细胞的快速光学操纵与物理特性实时检测技术细胞机械性能与其内在有机成分有着密切联系. 细胞骨架由微丝、微管和中间丝交错构成, 用以支持细胞、并行使细胞迁移、胞内物质运输及细胞分裂等功能. 细胞骨架不仅决定着细胞的机械强度与表面轮廓, 而且与细胞的各种功能密切相关. 当发生疾病时, 细胞功能的改变将直接导致细胞骨架变化. 医学研究证明, 细胞骨架变化将导致许多血液疾病. 在癌变过程中, 当细胞从正常状态发展到癌变状态时, 其细胞骨架将由规则的刚性结构变为非规则的柔性结构. 由于细胞骨架变化反应了细胞整体机械特性, 因此细胞刚性测量可以被认为是一种新的非生化手段标记法. 而且, 由于细胞拉伸技术所需要的样本数量非常少, 在临床上可以直接从病患的可疑部分如肺部、胃部、子宫颈等表面部位直接取样, 具有方便、快捷、准确等特性. 另外, 弹性是区分正常细胞与癌细胞最敏感的参数, 它可以定量分析及判断癌细胞的扩散程度.目前, 测试细胞骨架机械特性的技术有细胞微吸管技术、原子力显微技术、光镊微操纵技术等. 但这些技术都存在不同的问题, 如微吸管细胞操纵技术需要机械接触, 近场光学方法操24中国科学G辑物理学力学天文学第37卷作复杂和速度慢, 光镊由于需要在细胞样品上黏贴微颗粒, 也存在操作复杂和检测速度与流量较慢等问题. 因此, 发展新一代光学手段, 通过光学作用力与光学成像技术联用, 实现活体细胞骨架快速无损三维检测, 将是突破目前细胞骨架检测在临床医学应用的有效途径.由激光产生的光学作用力分为梯度力和散射力. 与梯度力相比, 光学散射力无需高倍显微物镜会聚产生, 其强度通常是相同激光光束产生梯度力的10倍以上. 因此, 利用光学散射力对活体细胞进行操纵, 将可使光学辐射损伤降到最小. 国际上已经开展了应用光学散射力检测细胞变形能力的研究, 例如对癌变细胞及其癌变阶段进行了弹性表征. 但是, 此类研究在采用光学手段方面, 仍然停留在定性检测水平. 需要进一步发展与光学成像手段联用的技术, 以便精确实时地检测细胞的形态变化. 如果使用相干光源成像检测, 将光学干涉测量法结合到传统的生物显微镜上, 就可以实现在亚微米精度上的三维形状实时测量. 再与散射力光镊结合, 即可实现高分辨率、无损伤的操纵、观察与测量.对于群体细胞检测, 通常需要先进行细胞筛分, 然后再进一步进行单细胞操纵与观察. 传统流式细胞仪具有高速多参量分离等优势, 但由于体积庞大、价格昂贵, 操作复杂等因素, 该技术不适用于小剂量的细胞筛分. 目前主流的小剂量细胞颗粒筛选通常在微型槽或微型腔中进行, 这样不仅节约成本, 而且大大提高了检测效率. 目前主要的筛分方法有电泳筛分、介电电泳颗粒筛分以及基于微颗粒物理扩散的筛分技术等, 其中电泳筛分的电场作用可能会影响活体细胞本身的生命活动, 而且电泳筛分通常需要进行荧光标记, 增加了筛分过程的复杂性. 介电电泳颗粒筛分技术由于易于集成化设计, 因此广泛应用于生物和生化领域细胞及颗粒的筛选, 但其缺点是筛分效率较低. 虽然基于微颗粒物理扩散的筛分技术是科学家近年提出的新技术, 已引起国内外广泛重视, 但由于其不适用于大至几微米的颗粒筛选, 所以暂时不能应用于通常大小的细胞筛分. 利用全光学方法实现细胞筛分是一种新方法, 其原理是使流动的细胞群通过三维光学晶格点阵, 利用细胞尺寸、折射率差异产生选择性偏折作用, 从而实现筛分. 由于该方法拥有连续筛选、非接触、指数级选择率等独特优点, 而且处理细胞速度超过30粒/s, 全光学细胞筛选技术已经得到广泛重视, 自2002年以来, 已经有多个国际小组启动了这方面的研究工作[2~7]. 在全光学筛分技术中, 虽然多光束干涉方法能够成功实现光学晶格点阵并筛分细胞, 但是该方法依赖于光学干涉, 对光路调节要求极高, 同时由于多光束干涉的限制, 光学晶格点阵的几何参数无法任意调节. 因此, 发展多自由度的全光学点阵筛分技术, 将为该技术的实际应用提供方便.国内在光镊领域的研究, 在过去15年里, 中国科技大学和中国科学院物理研究所等单位做了大量的工作[8,9]. 但是在利用光学散射力导致细胞变形、全光学点阵筛分技术和整合光学筛分、光学散射力、细胞光学三维成像等方面国内尚未见报道.1.2应用于亚细胞结构和细胞分子成像的荧光及Raman显微技术荧光显微技术已经成为细胞生物学研究的重要工具, 近年来取得了许多重要进展. 首先是荧光探针技术. 荧光探针是用来标记生物分子的, 要求具有高的荧光转换效率、小的体积、不影响被标记分子的性质、对所处微环境敏感等特点. 目前前景较好的荧光探针主要有两类, 一类是荧光蛋白[10,11], 另一类是量子点[12,13]. 前者已在活细胞内蛋白质分子间相互作用的研究中获得广泛应用, 后者也表现出突出的优越性, 如荧光强度高, 光谱宽度窄且分布对称, 荧光谱峰位置可通过改变量子点物理尺寸进行控制等. 这两种标记技术, 结合新型的探测技术, 在增 刊牛憨笨等: 细胞生命现象分析和研究的光学方法与手段25活体细胞生命现象的研究中将发挥重要的作用. 其次是多光子激发荧光技术. 单光子激发需要短波长激光, 甚至紫外光, 在活细胞研究中, 往往具有破坏性. 随着飞秒激光脉冲技术的诞生和走向成熟, 多光子激发荧光技术越来越受到人们的重视[14,15]. 多光子激发荧光技术具有许多突出的优越性, 例如, 它的非线性效应和超短脉冲效应使横向和纵向空间分辨率均获得改善, 从而为研究细胞内的动态过程创造了条件, 同时由于激发光可以是近红外光, 不会像紫外光那样对样品造成损伤, 还具有穿透深度深、激发荧光波长范围宽、激发光与荧光容易分离等优点. 随着飞秒脉冲激光器成本的降低, 它将会获得越来越广泛的应用. 另外, 在突破衍射极限提高空间分辨率方面也取得很大进展. 为了实现亚细胞结构和细胞分子成像, 亟待解决的问题之一是如何突破衍射极限, 提高空间分辨率. 人们曾通过不同的技术途径进行了研究. 对荧光显微成像而言, 最为成功的途径之一是受激发射耗尽(stimulated emission depletion, 简称STED)技术[16,17], 其基本工作原理是通过激发光束与另一束环形激光束共同作用, 设法使受衍射极限限制的激发光斑外围产生受激发射而不发射荧光, 只有环形中心部分才发射荧光, 通过时间同步和光谱分光技术将荧光和受激发射光分开, 从而获得超衍射极限的空间分辨, 所获得的空间分辨率小于35 nm. 还有荧光多参量成像技术也获得飞速发展. 除了荧光光谱和荧光强度成像技术外, 近年来还发展了荧光寿命成像(fluorescence lifetime imaging microscopy, 简称FLIM)技术、同时荧光光谱与荧光寿命成像技术以及同时荧光寿命与荧光偏振成像技术等. 通过对样品进行荧光寿命成像, 可以对分子所处微环境中的许多生物物理、生物化学参数如pH值、离子浓度、氧压、溶液疏水性及猝灭剂等的分布进行定量测量. 基于荧光寿命测量的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, 简称FRET)技术, 可以提供一种非常精确的研究蛋白质－蛋白质分子之间相互作用的手段[18,19]. 通过荧光偏振特性的测试可以获得影响荧光探针分子转动的有关待研究分子本身及其所处微环境的很多信息, 如: 分子体积、形状、质量以及微环境的黏滞度等, 从而得到蛋白质变性、蛋白质与其它物质结合以及蛋白质内部的动力学变化情况等信息[20]. 最后, 随着荧光多参量成像技术的发展, 对探测技术提出越来越高的要求, 不仅要以低的噪声、高的灵敏度探测微弱的荧光强度信号, 以高的时间分辨率测量荧光寿命, 还需要利用两维探测器以高的灵敏度和高的时空分辨率同时记录不同光谱的荧光寿命, 甚至多焦点处不同光谱的荧光寿命. 这些技术近年来都取得很大的进展. 在上述技术飞速发展的基础上, 除已有激光扫描共焦显微镜商品供生物学家使用外, 在实验室已研制成功基于飞秒激光器和时间相关单光子计数器的荧光寿命成像系统、基于超短脉冲激光器和门控像增强器及面阵CCD的多焦点荧光寿命及荧光偏振测试系统、基于多光子效应和同步扫描相机的荧光寿命或荧光多参量测试系统等, 并在实验室演示了这些系统在研究活细胞生命活动中应用的可行性.与荧光显微成像技术相比, Raman光显微成像技术的发展要缓慢得多. Raman光谱技术最大的优点是具有很高的分子特异性. 但其最大的缺点是信号微弱, 需要用很强的激光照射样品. 正因为如此, 数据采集时间过长和激发光功率过高是阻碍Raman光谱技术应用于活细胞研究的主要因素. 所以, 在Raman光谱学技术研究中, 如何有效提高Raman信号、缩短数据采集时间、降低激发光功率, 是众多研究人员关注的热点. 最主要的进展是1965年由Maker 和 Terhune提出的相干反斯托克斯Raman散射(coherent anti-stokes raman scattering, 简称CARS)技术[21], 它的转换效率比传统Raman散射提高了105倍, 且具有很强的方向性, 使信号采集效率大大提高. 1999年哈佛大学Xie小组利用两台可调谐飞秒激光器第一次对活细胞进行26中国科学G辑物理学力学天文学第37卷了高质量的CARS成像[22]. 近年来, 为了减小背景干扰和实现应用方便的背向CARS成像, 又做了大量的改进工作[23,24]. 在哈佛大学Xie小组的研究基础上, 日本Ichimura等人[25]将尖端场增强技术引入CARS成像技术之中, 极大地提高了空间分辨率(小于35 nm). 与医学成像技术相结合, 美国马萨诸塞州人民医院和哈佛大学的研究小组合作, 得到了皮肤的视频背向CARS 图像, 其卓越的成像效果打开了CARS进入医学领域的大门[26,27].我国在荧光显微成像技术的方法学研究方面已经陆续对双光子激发荧光、荧光寿命成像、荧光光谱成像以及FRET等方法及其应用方面开展了广泛研究, 并取得了一些高水平研究成果, 积累了较强的工作基础[28~31]. 作者所在研究小组首次提出了一种基于高重复频率皮秒扫描相机的同时光谱和时间分辨多焦点多光子荧光显微功能成像技术[32,33]. 在Raman谱生物医学领域的研究中, 大多使用成熟的商业化仪器, 测量单点Raman谱线, 无直观的图像, 且无法与传统的研究方法得到的数据进行比对, 因此在生物学应用中受到了一定的限制. 中国科学院上海光学精密机械研究所在国内率先开展了CARS的理论研究工作[34]. 但总体来说, 我国在荧光和Raman光显微成像方面的发展远不能满足细胞组学研究发展的要求.1.3应用于亚细胞结构研究的表面等离子增强技术表面等离子共振成像是利用样品表面折射率变化而引发的等离子体和倏逝波之间共振角度的改变来检测样品的表面特征. 20世纪80年代, 瑞典科学家Liedberg首次将表面等离子共振成像技术运用于IgG抗体与其抗原相互作用的测定[35]. 1990年, 瑞典的Biacore AB 公司开发出世界上第一台商业化的表面等离子共振生物传感器BiacoreTM[36], 随后不断有专业化的商用表面等离子共振生物传感器平台相继推出, 从而被广泛应用于从蛋白、寡核苷酸、寡糖、脂类到小分子、噬菌体、病毒颗粒、细胞等各种生物体系, 从根本上改变了生物分子识别科学, 成为生命科学和制药研究中的重要手段. 表面等离子共振成像其垂直方向的分辨率达到纳米量级, 因此广泛应用于细胞运动、胞内运输以及细胞之间相互作用的实时监测.现有的表面等离子共振成像系统通常运用机械旋转镜来调节入射光角度以达到与最佳成像角之间的吻合. 这种方法难以控制入射角的精度, 并且在检测不同种类细胞时需要重新校正部分装置, 很大程度上限制了表面等离子共振成像方法的应用. 为此, 我们在表面等离子共振成像系统中引入计算机控制的高精度压控振镜以解决传统系统的缺点, 从而大大提高成像系统的灵活性和优越性, 实现高通量的成像效果. 在利用表面等离子共振成像或监测时, 样品位置的控制以及细胞表面与金属薄膜层之间的距离直接影响成像效果. 因此分子敏感膜在连接样品与金属薄膜层的作用上就显得极为重要. 现阶段分子敏感膜的成膜方法如金属膜直接吸附法、共价连接法、单分子复合膜法、分子印膜技术等都要引入额外的吸附材料, 不易灵活操作, 而且容易造成细胞和金属薄膜层的损伤, 吸附的准确性和成功率也难以保证. 为此, 我们引入无任何机械损伤又行之有效的固定手段——光镊, 通过聚焦激光入射介质时光子与微粒发生动量交换完成对细胞的捕捉、移动甚至转动, 而且, 通过微光学器件(如微透镜阵列、达曼光栅等)投影产生聚焦光点阵列可以对多细胞同时进行捕获与固定. 虽然目前已有关于利用表面等离子共振技术进行生物传感检测的成熟商业化仪器, 但是表面等离子波作为纳米荧光探针在细胞面形和亚细胞结构成像研究方面, 尤其是作为荧光激发方法, 还有许多新的内容需要研究. 例如, 2000年德国科学家首次提出表面等离子激发荧光光谱方法[37], 同等条件下, 该方法比全内反射荧光显微术(total internal reflection fluorescence microscopy, 简称TIRFM)的。