产物1 产物 产物2 产物
多重PCR引物设计 引物设计 多重
1)产物大小易于分离 产物大小易于分离 2)引物 引物23-28 nt, 较高特异性 引物 3) G+C含量相近 55%左右 含量相近, 含量相近 左右 4) 优化 优化PCR条件 以适应多对引物扩增的要求 条件, 条件
进行性肌营养不良症(DMD) 进行性肌营养不良症 基因全长2000-2500kb 基因全长 60%缺失突变 5%重复突变 缺失突变, 重复突变, 缺失突变 重复突变 35%小片段缺失或点突变 小片段缺失或点突变 突变的热点区在基因的中央部第45-55外显 外显 突变的热点区在基因的中央部第 子和5’区 子和 区 外显子4、 、 、 、 、 、 、 、 外显子 、8、12、17、19、44、45、48、 51位点的 对引物 检出 位点的9对引物 位点的 对引物, 检出90%的具有基因缺 的具有基因缺 失的病例
β-地中海贫血 地中海贫血
Hph I βΑ GGTGA Hph I βΤ GATGA βΑ βΑ βΤ βΤ βΑ βΤ 正常 纯合子 杂合子 1.4kb 1.2kb
Lener 遗传性视神经病
线粒体DNA的11778位G 的 线粒体 位 正常 G PCR G G G SfaN I 340 bp 190 bp 150bp PCR A A A SfaN I A 病变 A
二、基因诊断中常用的分子生物学技术
核酸分子杂交 聚合酶链式反应 （PCR） ） 单链构象多态性（ 单链构象多态性（SSCP）检测 ） 限制酶酶谱分析 DNA芯片技术 芯片技术 DNA测序 测序 DNA多态性连锁分析 多态性连锁分析
三、基因诊断的特点
♣高度特异性 高度特异性 ♣高灵敏度和精确性 高灵敏度和精确性 ♣早期快速 早期快速 ♣诊断范围广，适应性强 诊断范围广， 诊断范围广 ♣可用于非活体标本 可用于非活体标本 ♣DNA水平具有体细胞稳定性 水平具有体细胞稳定性
应用篇第二章 应用篇第二章 基因诊断
Gene Diagnosis
一、基本原理 基本原理
基因诊断：通过检查基因的存在、缺陷或 基因诊断：通过检查基因的存在、 表达异常， 表达异常，对人体状态和疾病 作出诊断的方法和过程。 作出诊断的方法和过程。 基本原理：检测 基本原理：检测DNA或RNA的结构变化与 或 的结构变化与 的多少及表达功能 表达功能是否 否，量的多少及表达功能是否 正常， 正常，以确定被检查者是否存 在基因水平的异常变化， 在基因水平的异常变化，以此 作为疾病确诊的依据。 作为疾病确诊的依据。
2. 大片段丢失或插入的诊断
PCR: 0.5-1.5 kb DNA片段的丢失或插入 片段的丢失或插入
多重PCR ( multiplex PCR): 在同一个 在同一个PCR体系 多重 体系 中加入多对引物, 中加入多对引物 扩增同一模板的几个区域
引物1 引物
引物3 引物 致病基因 引物2 引物 引物4 引物
2. DNA重复序列多态性分析 重复序列多态性分析 (variale number of tandem repeat, VNTR)
H3 H1 A B C D H1: Hinf I; H3: Hae III AB CD AB CD H1 H3 H1 H3
DNA指纹技术 (DNA finger printing) 指纹技术
更能反映基因组的特异性 具有高度特异性 具有稳定的遗传性 具有体细胞稳定性
个人识别 亲子鉴定 法医物证检测
(三) 基因表达异常的诊断 三
*Northern、斑点杂交或狭缝杂交检测RNA 、斑点杂交或狭缝杂交检测 表达量的变化 *RT-PCR推算出mRNA的相对含量 *RT-PCR推算出mRNA的相对含量 推算出 *RT-PCR/竞争 竞争PCR计算 计算mRNA的绝对含量 竞争 计算 的绝对含量 *Northern杂交 杂交mRNA长度的变化 杂交 长度的变化
1. 限制性片段长度多态性 限制性片段长度多态性RFLP
如果DNA多态性涉及到某个限制性内切酶的识别 多态性涉及到某个限制性内切酶的识别 如果 位点, 用此酶酶解DNA时产生不同长度的 时产生不同长度的DNA片段 位点 用此酶酶解 时产生不同长度的 片段 RFLP分析方法 分析方法: 分析方法
DNA DNA 限制性内切酶酶解 PCR Southern杂交 杂交 电泳
链B 非变性 链B’ 电泳
链A 链A’
链B 链B’
DNA芯片技术分析 芯片技术分析 A C T G
正常 C T 纯合子
探针定位
C
T
C
G
C
A
杂合子
新突变
新突变
DNA芯片技术可用于大规 芯片技术可用于大规 模的未知突变的筛查
n个碱基中每个碱基的变 个碱基中每个碱基的变 异，需探针4×n； 需探针 × ； 4 kb序列， 需 序列， 序列 4×4000=16000个寡核苷 × 个寡核苷 酸探针
引物1 引物 突变位点 引物2 引物 正常序列 异常序列 正常探针 异常探针
CATTGCCGTCATGCTGCGA CATTGCCGTTATGCTGCGA GTAACGGCAGTACGACGCT GTAACGGCAATACGACGCT 正常探针 异常探针 基因型 斑 点 杂 交
+ + -
+ +
正常 杂合子 纯合子
六、基因诊断的基本方法
(一) 基因突变的分子诊断 一 (二) 多态性分析 二 (三) 基因表达异常的诊断 三 (四) 外源 四 外源DNA检测 检测
1. 点突变、少数核苷酸缺失或插入的诊断 点突变、 (1) 诊断已知的点突变 PCR/ASO探针法 诊断已知的点突变: 探针法 ASO: allele specific oligonucleotide, 等位基因特异性寡核苷酸 SSO: sequence-specific oligonucleotide 序列特异性寡核苷酸
限制性内切酶酶解
由于DNA固有的特点 某一基因相对固定地存在于某一个或 固有的特点, 由于 固有的特点 片段中。当结构基因的DNA突变（包括点突 突变（ 某几个限制性 片段中。当结构基因的 突变 缺失、插入等）而致病时， 变、缺失、插入等）而致病时，限制性内切酶酶切位点改 使原切点消失，或产生新的位点，或识别位点移位。 变，使原切点消失，或产生新的位点，或识别位点移位。
四、基因诊断的应用领域
1. 诊断疾病 2. HLA的基因分型 的基因分型 3. 个体遗传基因的鉴定 4. 性别鉴定 5. 生物分类 6. 法医学
五、基因诊断的病因范围
1. 基因结构的改变 点突变、插入、 点突变、插入、缺失 重排、易位、 重排、易位、基因扩增 基因结构多态性变异 前病毒插入等 2. 基因表达状况的改变 3. 病原体的侵入
3. 基因重排 (染色体移易位 的诊断 染色体移易位) 染色体移易位
引物1 引物 正常位点 引物2 引物 目标基因 引物3 引物 目标基因 引物3 引物
重排位点
Philadelphia 易位 t(9;22)融合了 和abl基因 易位, 融合了bcr和 基因 基因, 融合了 导致慢性粒细胞性白血病
4. 基因扩增的诊断
核酸分子杂交检测 癌基因活动情况
Northern BlA
32P-N-ras
癌基因探针
肝癌组织中 N-ras 癌基因活动
(四) 外源 四 外源DNA检测 检测
细菌 病毒 支原体 衣原体 立克次体 寄生虫
核酸分子杂交检测 HBV基因与人体细胞基因组整合 HBV基因与人体细胞基因组整合
Southern blot 特异条带强度的改变 特异条带强度的改变 强度 单拷贝基因对照
(二) DNA多态性分析 二 多态性分析
在同种生物不同个体的基因组中,核苷酸序列 在同种生物不同个体的基因组中 核苷酸序列 存在差异性, 称为DNA的多态性 (polymorphism) 存在差异性 称为 的多态性 第一代标记: 限制性片段长度多态性 第一代标记 (restriction fragment length polymorphism, RFLP) 第二代标记: 重复序列多态性, 第二代标记 重复序列多态性 短串重复序列 (short tandom repeat, STR) 第三代标记: 第三代标记 单碱基多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP)
Southern Blot
正常 肝癌 慢肝 慢肝活动
32P -HBV探针 肝组织DNA 肝组织DNA HBV探针 肝癌细胞基因组 和慢性活动性肝炎肝细胞有HBV整合 和慢性活动性肝炎肝细胞有HBV整合
遗传病(genetic disease)的基因诊断 遗传病 的基因诊断
基因异常 方法 探针、 探针、引物和 限制酶 缺失基因探针 缺失部位引物 切点消失限制酶 正常/异常探针 突变部位引物
基因缺失 基因组 DNA 印迹杂交 PCR 扩增 点突变 RFLP 分析 ASO 杂交 PCR 产物多态性分析 DNA 测序
(2) 诊断未知的突变 PCR/SSCP/ 测序 诊断未知的突变:
SSCP: single strand conformation polymorphism 单链构象多态性
基因型： AA BB AB CC AC DD
C A B D，D’ ， A’ B’ C’ C’
PCR 32P-dCTP
链
变
性
链A 链A’