EPO工程细胞大规模 培养方法和反应器
红细胞生成素(erythropoietin,EPO)
红细胞生成素(erythropoietin,EPO) 是一种糖蛋白,它是红细胞发育成熟过 程中的一种最重要的调节因子,它在治 疗肾衰引起的贫血中,显示明显的疗效 和很小的副作用;在纠正恶性肿瘤相关 贫血、艾滋病引起的贫血和化疗引起 的贫血等方面,也显示乐观的前景;还 可在手术前作为自体输血,从而避免感 染血源性疾病等等。因此EPO是很有 前途的一种细胞因子
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1.胰岛素:细胞无血清培养中,胰岛素的 使用浓度为0.1~10μg·mL-1。胰岛素可 以促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成, 抑制细胞凋亡,是重要的细胞存活因子, 部分学者认为在批式培养中胰岛素迅速 耗尽是细胞比生长速率下降的主要原因。 CHO细胞能在仅含重组人胰岛素一种蛋 白成分的无血清培养基中连续传代
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无血清培养基展望
培养基中所添加的蛋白成分主要还是 来源于动物或人,仍然存在病毒污染的 危险,只有完全采用非动物来源的材料, 才是相对安全的,而植物提取物将是理 想的选择.可以这样预测,未来开发的新 一代无血清培养基,将是一种既无血清、 无蛋白,又可以高温消毒,且适合于多种 不同细胞生长的全能型培养基
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搅拌叶轮种类
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Celligen 系列生物反应器的特点
1. 适合贴壁培养细胞和悬浮细胞,适合各 种动物细胞,昆虫细胞和植物细胞等 2. 灌流式的培养过程 3. 低（无）剪切力搅拌,无气泡通气； 4. 特殊的贴壁载体,比表面积大,静止培养 5. 通过持续检测摄氧率实时检测细胞浓 度 6. 符合现行药品生产质量管理规范 (cGMP)
合成培养基
无血清培养基
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无血清培养基
无血清培养基是在合成培养基内加 入不同种类的补充因子而替代PBS的培 养基. 它避免了血清培养基污染的可能性, 并排除了批次间的差别还减少了纯化的 难度.但无血清培养基没有广泛的适应 性,不同的细胞甚至不同的细胞株和细 胞系有各自独立的无血型培养基配方.
1. 适合贴壁培养细胞和悬浮细胞,适合各 种动物细胞,昆虫细胞和植物细胞等 2. 灌流式的培养过程 3. 低（无）剪切力搅拌,无气泡通气； 4. 特殊的贴壁载体,比表面积大,静止培养 5. 通过持续检测摄氧率实时检测细胞浓 度 6. 符合现行药品生产质量管理规范 (cGMP)
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灌注培养
灌注属于连续培养,细胞保留在反应 器系统中,收获培养液的同时不断加入 新鲜培养基. 灌注培养的主要优点是连续灌注的培 养基可以提供充分的营养成分,并带走 代谢产物.同时,细胞保留在反应器中,可 以达到很高的细胞密度.同其他方法相 比,灌注培养的产率可以提高一个数量 级,并可以大大降低劳动力的消耗.
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2.转铁蛋白:大多数哺乳动物细胞上存在特定的 转铁蛋白受体,受体与转铁蛋白/Fe3+复合物 结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来 源,此外转铁蛋白还具有生长因子的性质并能 与其他微量元素如钒等结合。转铁蛋白的使 用浓度为0.5~100μg·mL-1,亦有研究报告指出, 无血清培养基中必须要有转铁蛋白至少 5μg·mL-1,胰岛素才能起作用。也有资料证实 转铁蛋白在无血清培养基中的作用可以为某 些铁盐所代替,如柠檬酸铁、二甲胂酸铁、葡 糖酸铁等。
篮式纤维填充床
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Celligen系列生物反应器工作原理(P113)
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用无血清培养基在填充床生物反应器 邓继先等 生产rHuEPO
军事医学科学院生物工程研究所
文摘
在填充床生物反应器用含5%FBS的DMEM:F12 培养基培养产重组人促红细胞生成素(rHuEPO)的细 胞CHO8~10d后,使用自制的无血清生产培养(SFM-p) 生rHuEPO。SFM-p培养基既能维持细胞生长,又能生 产EPO,也便于纯化分离rHuEPO。使用填充床生物 反应器培养细胞,能维持培养20~25d,rHuEPO表达水 平达12~28· 4mg/L之间,反应器的产率达71· 0mg/L/d, 比滚瓶的产率增加12~14倍。葡萄糖最高消耗量达到 21g/L/d,细胞培养密度最高达到3· 0×107/ml以上,每 次可收无血清培养上清80~87L。由于细胞被固定在 聚酯片上,培养上清中脱落细胞很少。观察了反应器 的乳酸和氨的含量,其结果表明乳酸和氨含量分别低 于3· 5g/L和5mmol/L,不影响产物的表达。经过多批培 养和生长HuEPO的结果表明,自行配制的SFM-p培养 基在该反应器能有效地维持细胞生长和生产rHuEPO 。 39
用于基因重组促人红细胞生成素 (Recombinant human erythropoietin, rHuEPO)生产且不含牛血清白蛋白的无 血清培养基-p (Serum free medium-p, SFM-p)培养液,就是在达尔贝可改良的 伊格尔(Dulbecco s modified Eagle s medium, DMEM)∶F12 (1∶1)培养基中 添加了Se、乙醇胺、多种维生素、蛋白 胨、胰岛素、转铁蛋白和一些细胞因子 等成分构成的专用培养基
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填充床生物反应器
动物细胞大规模培养需要合适的生物 反应器. 目前国内用的比较多的适合 CHO细胞生长并能高效表达产物的反应 器是填充床式生物反应器,其中比较有 名的是美国NBS公司生产的Celligen系 列.
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Celligen plus
Celligen 310
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Cellgen 系列生物反应器的特点
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补充因子是无血清培养基中各种血清替代成 分的总称。补充因子的种类繁多,主要有生物 大分子、小分子和微量元素等。补充因子又 可归类为必需补充因子和特殊补充因子。 必需补充因子:胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠 所有的细胞株在无血清培养基中生长时都需 要的, 特殊补充因子:①生长因子②激素③贴壁因子 ④其它补充因子
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rhEPO的工程细胞
rhEPO (人重组红细胞生成素) 的 工程细胞通常使用CHO细胞,因为CHO 细胞是重组糖蛋白生产的首选体系,而 rhEPO就是一种糖蛋白.CHO细胞是体 壁依赖性细胞.
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rhEPO工程细胞CHO
微载体
培养基
生物反应器 培养参数 分泌产物 分离纯化 rhEPO
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培养基
天然培养基
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微载体
微载体培养是细胞在由葡聚糖制成 的小球表面成单层生长,通过轻轻搅拌 使细胞维持悬浮状态。这种培养较传统 的单层细胞培养,面积大大增加,将这种 微载体在流化床式、固定床式反应器中 进行培养,则可获得比原来多20~50倍的 高密度细胞.
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常用的微载体
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Cytodex微载体上细胞生长情况
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pore的性质
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动物细胞生物反应器
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常见动物细胞生物反应器类型
气升式(airlift)生物反应器 中空纤维管(hollow-fiber)生物反应器 流化床(fluidiz-bed)生物反应器(FBR) 搅拌罐(stir-tank)生物反应器(STR) 固定床(fixed-bed)生物反应器 填充床(packed-bed)生物反应器
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使用无血清培养基的问题
无血清培养基虽然在各个方面都显示出其 强大的优势和发展前景,但采用无血清培养而 诱发的细胞凋亡也成为动物细胞无血清培养 技术中亟待解决的问题.在培养基中加入某些 化合物,如金精三羧酸(Aurint ricarboxylic acid, ATA)、锌离子、抗氧化剂和细胞因子 等,在一定程度上可阻止因采用无血清培养 基而导致的细胞凋亡.
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3.亚硒酸钠:Hewlett在1991年曾指出硒在 任何一种细胞,特别是人体细胞的生长 过程中确实具有明显作用,微量元素硒 参与谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧 化酶的作用过程,消除氧化物酶和氧自 由基对细胞的伤害。亚硒酸钠的最适添 加浓度是30~60nmol· L-1。
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生产rhEPO的无血清培养基
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Celligen 系列生物反应器的特点
1. 适合贴壁培养细胞和悬浮细胞,适合各 种动物细胞,昆虫细胞和植物细胞等 2. 灌流式的培养过程 3. 低（无）剪切力搅拌,无气泡通气； 4. 特殊的贴壁载体,比表面积大,静止培养 5. 通过持续检测摄氧率实时检测细胞浓 度 6. 符合现行药品生产质量管理规范 (cGMP)
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Cell igen系列使用的载体—FibraCel(聚酯片)
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FibraCel的技术指标
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FibraCel的电镜照片
无细胞生长的FibraCel
HEK293细胞在FibraCel 上生长4天的情况
HEK293细胞在FibraCel 上生长7天的情况
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FibraCel适用的细胞种类
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