第一部分：分子克隆技术
将外源（某载体上的水稻）DNA
片段亚克隆到另一载体上。
pU1301
CaMV 35S promoter
Hin dIII (13575)
Terminator
Bam HI Sma I Kpn I (13246)
TEV Leader
Eco RI (13066) Eco RI (12426) Nco I (12076) Nco I (1)
制蛋白质的合成（使用浓度：50µ g/ml)
RNaseA: C 或 U 的 3’ － P 与相邻的 5’ － OH 处切开 RNA 。
配制：一般以10mg/ml溶于TE中，然后在沸水中煮 15分钟，分装成小份储存于－20℃。
质粒DNA质量检测
1. DNA 纯度：吸光值检测：检测 260nm 、 280nm 吸光值，紫外分光光度计 A260/A280=1.8 － 1.9 ；
pU1301+1.5KB外源
• 双酶切： BamHI+KpnI
ALPHA
pUC19
Eco RI (397 )
P(BLA)
Acc 65 I (409) Ava I (41 3) Xma I (41 3) Kpn I (41 3) Sma I (41 5 )
AP r
pUC19
2686 bp
Bam HI (41 8) Pst I (440) Hin dIII (448)
实验材料
携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液； 携带含有水稻 DNA 片段的 pU1301 载体的大肠杆菌 菌液。
操作步骤
1. 取含有相应载体的大肠杆菌菌液于含有相应
抗生素的 LA 培养基上涂布或划线分离单菌落，
37℃过夜培养）；
2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗
生素的LB培养基中，37℃摇床~250 r/min过夜
混合后依次加入点样孔中；
5. 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开 电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔
在电泳槽的负极一端）；
6. 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 µ g/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡10－15 min， 在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。
质粒电泳检测
一般有一至三条带（质粒DNA的三种构型）
试剂的作用（二）
Solution III 中和后，宿主 DNA 由于很大，碱基 还未来得及配对就在冰冷的条件下与 SDS、蛋白 质、高分子量的 RNA 等缠绕在一起沉淀下来， 而质粒 DNA 由于很小且双链未分开，能够迅速 配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。
试剂的作用（三）
1. 苯酚/氯仿： 纯化质粒，去除质粒溶液中残留的 蛋白质等杂质； 2. 无水乙醇或95%乙醇或异丙醇：沉淀质粒DNA 3. TE 或H2O：溶解质粒DNA
典型的限制性内切酶作用的缓冲体系成分包括：
氯化镁、氯化钠/钾、Tris盐酸盐、 β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）、
牛血清白蛋白（BSA）
注意
1. 注意阅读商家提供的产品说明书，了解所使用工具酶 的浓度和最适作用条件，不要用错了Buffer和作用的
温度等；
2. 涉及到酶的操作时,一律在冰上操作；
1.8最佳，低于1.8说明有蛋白质，大于1.8说明有
RNA。 2. 质 量 检 测 ： 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ： 一 般 有 三 条 带 （超螺旋、开环、线型三种构型），点样孔附 近无DNA带（无染色体DNA污染）。
3. DNA的定量
（1）荧光检测仪 Hoechst33258: 可 与 纳 克 级 的 DNA 结 合 ， 而 几 乎 没 有
Gus first exon Catalase intron Gus second exon Histidine tag
Bst EII
Mazie Ubiquitin promotor
Kpn I (11754) Sal I Hin dIII (11015) Bst XI
Nos poly-A
CaMV35S promoter
Xho I (9995)
PU1301
T-Border (right)
14336 bp
pVS1 sta
hygromycin (R)
Xho I (8901)
CaMV35S polyA T-Border (left)
Sac II
pVS1 rep
kanamycin (R)
pBR322 bom pBR322 ori
碱裂解法用到的试剂
Solution I: Tris.HCl （pH 7.5） 50 mM EDTA 10 mM RNase A 100 µ g/ml Solution II: NaOH 0.2 M SDS 1% Solution III: Final concentration KAC 1.32 M Using HAC to adjust pH to 4.8
TE (pH 8.0)： Tris.HCl （pH 8.0） EDTA （pH 8.0） 苯酚/氯仿 无水乙醇或异丙醇 10 mM 1 mM
试剂的作用（一）
Solution I: 重悬细菌; Solution II: 其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞 内容物释放出来，NaOH 使DNA变性、碱基对打 开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的 质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开;
3. 使用移液器吸取酶时，tip头只能刚刚插入液面吸取；
4. 如果有多个反应，酶、buffer、水等应配制成mixture
再分装；
5. 各种成分加完后应混匀，然后在离心机上短暂离心。
BamH I：
G▼GATT C C CTAA▲G
Kpn I:
G GTAC▼C C▲CATG G
含外源DNA片段的载体(M812) 的限制性内切酶消化 目的载体（pUC19)
P(LAC) ORI
分子克隆的主要步骤
1. 两种载体的抽提
2. 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量
3. 两种载体的限制性内切酶消化
4. 目的片段的回收及亚克隆载体的去磷酸化
5. 载体与外源DNA的连接 6. 感受态细胞的制备 7. 连接子转化感受态细胞 8. 重组子筛选及鉴定
质粒载体的提取
载体必备条件
质粒的提取
碱裂解法，主要包括4个步骤： 1. 细菌的培养：从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的 培养基中，培养至对数生长后期；
2. 菌体的收集和裂解：通过离心收集菌体，NaOH/SDS处理
裂解细胞； 3. 染色体DNA 、RNA 及其它杂质的去除：碱处理后用冰冷的 KAC 缓冲液处理后离心； 4. 质粒的纯化及沉淀：苯酚氯仿抽提，乙醇或异丙醇沉淀。
开环
线型 超螺旋
不同末端克隆的要求及特点
外源DNA 克隆的要求
线状质粒DNA常 需用磷酸酶 （CIP）处理

特点
一般酶切位点常可保留 外源DNA会以两个方向插入 重组质粒可带有外源DNA的串联拷贝 一般酶切位点可保留, 非重组克隆背景低 不需CIP处理 外源DNA只以一个方向插入重组质粒中 不同酶切的平头可连接 非重组克隆的背景高 质粒及外源DNA连接处的酶切位点消失 （不同平端酶） 重组质粒可能带有外源DNA的串联拷贝
培养；
3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g离心1分钟，收集菌体， 倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽 量将菌液倒干净； 4. 加入300l Solution I振荡打匀，重新悬浮细胞， 震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； 5. 加入300l Solution II，轻柔颠倒混匀，放置至 清亮，一般不超过5分钟（最好不超过2分钟）； 6. 加入300l Solution III颠倒混匀，放置于冰上10 分钟，使杂质充分沉淀；
（50 l反应体系，用1.5 ml tube，冰上操作） 质粒 DNA 30 l
BamH I (10u/µ l)
Kpn I (10u/µ l) 10×buffer ddH2O Total
1 l
x 9 = 9ul
1 l x 9 = 9ul
5 l 13 l 50 l x 9 = 45ul x 9 = 117ul
分别取5 l 酶切产物用0.8％－1.2%凝胶检测酶切效果
电泳检测
点样顺序： 1. Marker 2. pUC19质粒对照 3. pUC19质粒酶切产物
4. M812 质粒对照
5. M812 质粒酶切产物
2011本科生酶切图片
• • • • • lane1-4, pUC19酶切产物 Lane5 , pUC19质粒 Lane6， M812质粒 Lane7-10, M812 酶切产物 Lane11, DL-2000 marker,
RNA or SS－DNA
琼脂糖凝胶电泳检测
1. 将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中，水平放
置在工作台上；
2. 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微
波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时
倒胶；
3. 凝胶凝固后，小心拔去梳子；
4. 将5µ l DNA样品与1µ l上样缓冲液和4µl H2O
7.
12000 g离心10分钟；
8.
吸取800l 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂 质）至另一个 1.5ml 离心管中，加入 2/3 体积的 异丙醇，室温下放置5分钟；
12000 g 常温离心15分钟；
9.
10. 倒尽上清，加500 l 75％乙醇浸洗除盐，（放 置片刻后离心5分钟，弃上清） 11. 彻底干燥后加40l 灭菌超纯水溶解； 12. 质粒的质量检测，-20℃保存。
试验中用到的抗生素和酶
氨苄青霉素（ Ampicillin ）： 其主要是通过抑制细胞
壁的合成杀死正在生长的大肠杆菌。