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转基因动物实例四
正在进行转基因山羊的实验 乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊
上海交通大学医学遗传研究所
just a joke
转基因动物操作技术流程
获取外源目的基因
简
含有外源目的基因的重组载体导入生殖细胞或胚胎干细胞
明 操
选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物 作 步
转基因胚胎的发育及鉴定
骤
筛选所得的转基因动物
转基因技术操作的具体流程
一、目的基因的设计
转基因可分为随机整合型基因和基因敲除（gene knockout）型载体基因。随机整合型基因要求结构完整，包 括5，改造基因可选择不同的 启动子来控制外源基因表达的组织特异性。基因敲除（gene knockout）型载体基因要设计与待剔除基因的同源性的载体 基因。
注意事项：
1. 显微注射法将外源基因导入生殖细胞和体细胞后， 在染色体上的整合位置是随机的.
2. 外源基因甲基化程度在胚胎发育过程中会影响其 活性.
二、重组载体的构建
选择合适的基因载体，要求载体序列不干扰外源基因的表达、 能接受外源DNA容量大小、稳定、有一定滴度、对宿主细胞 无威胁。
三、重组载体的体外验证（in vitro） 重组载体的正确性验证，如拷贝数、连接方向等。对于连有 组织特异性启动子或局部体细胞转染的载体，需先在同类 型的体外离体培养细胞中初步验证表达特性。
转基因动物是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因内稳定 整合并能稳定表达和遗传的一类动物（包括基因敲除的动物）。
1982年，华盛顿大学制备的著名“超级小鼠”－将大鼠生长激素导入小鼠
4，转基因动物技术
转基因动物技术是指借助基因工程技术将体外重组 的结构基因导入受精卵或早期胚胎，培育出转基因 动物的技术。
3、转基因动物
转基因动物(Transgenic Animal)是指通过实验方法，人工地把 人们想要研究的动物或人类基因，或者是有经济价值的药物 蛋白质基因等，通常称为外源基因，导入动物的受精卵（或 早期胚胎细胞），使之与动物本身的基因组整合在一起，这 样外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一 代的一类动物。 （曾溢滔院士）
7、转YAC的转基因小鼠 近10年内，陆续出现用全长酵母人工染色体（YAC）DNA 来产生转基因小鼠。
转基因动物实例一
超级奶牛－普通奶牛的三倍大 （英国）
转基因动物实例二
东北农业大学－国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪
绿色荧光蛋白－猪胎儿成纤维细胞－克隆
转基因动物实例三
转绿色荧光蛋白的兔
四、转基因鱼
• ⑶对幼鼠鉴定
用显微注射方法制备转基因动物，操作技术性 很强，即使是受过严格训练的专业人员操作， 发育成转基因动物的受精卵也只占注射卵的5 ％。因此人们往往来用增大微注射受精卵的 数目的办法来弥补这一缺陷。
优点： 外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过
程直观； 整合率高 缺点： 设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求 低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性 转基因沉默
转基因动物技术的发展简史回顾
1、第一例嵌合体小鼠 1974年最早把猿猴病毒40(SV40)注入小鼠囊胚腔中（如图），得 到部分组织中含有SV40DNA的嵌合体小鼠。但无任何表型改变。
2、第一个转基因小鼠系 1976年建立了世界上第一个转基因小鼠系，这些小鼠基因组中
插人了莫氏白血病病毒基因。他们是运用反转录病毒与小鼠卵裂 球共培养把外源DNA插入到小鼠的基因组中。
• 六、组建转基因系 • 第一代转基因动物是半合子转基因动物，因为
外源基因仅在一条染色体上稳定整合。只有通过 选种选配，将两个半合子转基因动物成功交配， 才能得到纯合子转基因动物，建立转基因动物家 系，外源DNA才能在后代中稳定遗传。
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转基因动物的制作方法
一、受精卵雄原核显微注射法 二、胚胎干细胞（ES细胞）法 三、逆转录病毒感染法 四、体细胞核移植法 五、精子载体法 六、YAC法
一、雄原核显微注射法
以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技 术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的 原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体 输卵管继续发育获得转基因动物个体。
目前应用较广泛，最早最经典的方法。
这一方法的实验程序如下：操作过程 ｂ显微注射 ｃ假孕母鼠准备(养母) ｄ胚胎移植
5、转基因家畜的产生 转基因家兔、绵羊和猪(Hammer等，1985)、牛(Bondioli
等，1988)和山羊(Ebert等，1991)等相继出世。
6、利用转基因生产重组蛋白 1987年，Simons等在转基因小鼠的乳汁中得到绵羊的β-球 蛋白，1988年，该研究小组又从转基因绵羊的乳汁中得到 了α-抗胰蛋白酶。目前，已有数十种蛋白实现了转基因生产。
四、基因转移 基因转移方法主要有3类： 1）化学法 2）物理法 3）生物法
五、转基因动物模型的验证
国外杂志一般需要从基因组、mRNA、蛋白质和整体 表 型 各 个 层 次 进 行 验 证 。 FISH 杂 交 、 聚 合 酶 链 反 应 （ PCR ） 、 免 疫 印 迹 杂 交 （ Southern Northern blotting）、酶联免疫法、免疫荧光法和Western杂交法 等多种方法，先筛选出有外源基因整合的阳性动物，传 代后分别在mRNA和蛋白水平上检测外源基因在转基因 动物中的表达情况，对外源基因表达产物的生物活性和 生化性质进行鉴定，以及检查转基因动物的生理功能和 是否出现某些疾病病症状的表型等。
3、第一例显微注射法产生转基因小鼠 1980年，Gordn等把SV40DNA显微注射到小鼠受精卵的原核
中，获得了两只转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。
4、“超级鼠” 1982年，Palmiter和Brinster用此方法把大鼠的生长激素
基因导入小鼠受精卵，获得了成年体重是对照组小鼠2倍的 “超级鼠”，首先证明外源基因可在受体中表达，并且表达 产物具有生物活性。