(二)核酸外切酶III （三）核酸外切酶VII （四）DNA酶I （五）RNA酶A (牛胰) （六）RNA酶TI （七）RNA酶H
第三节基因工程的载体 （Vector）
• • • • • • • • • • • 到目前为止，用于基因工程的载体有8类： ① 细菌质粒载体；包括大肠杆菌和枯草杆菌质粒载体。 ② λ噬菌体衍生载体。 ③ 柯斯质粒(Cosmid)载体：一种由质粒和A噬菌体cos尾巴构建 的复合载体。 ④ 噬菌体M13衍生载体一类专门用于Sanger法测序的载体。 ⑤ Phag9m5d载体：一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合 载体。 ⑥ 酵母质粒载体：由酵母2u质粒构建的酵母基因工程载体。 ⑦ 真核病毒载体：包括动物病毒、植物病毒衍生载体。 ⑧ 杆状病毒和Bacmid载体；
瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组 稳定转染 目的基因整合进宿主基因组
第三节
转基因动物技术
一、转基因动物的概念 转基因技术是将外源DNA导入细胞的一种技 术。它是在DNA重组技术的基础上发展起来的。 1981 年 Gordon 和 Ruddle 首 次 用 显 微 注 射 法 (Microinjection)把外源基因导入小鼠受精卵的 雄核，并将注射后的受精卵植入假孕母鼠子宫， 产生了的78只小鼠，其中有2只的所有细胞中 (包括生殖细胞)都含有外源基因，但因缺乏启 动子而不能表达，他们把出生后带外源基因的 小鼠叫做转基因小鼠(Transgenic Mice)，自此 以后，凡带有外源基因的动物都叫做转基因动 物(Transgenic animal)。
六、转化细胞的筛选与鉴定
• 转化或转染的效率是很低的(一般为105～ 106)，也就是说，只有极少数细胞接受到 重组DNA分子，能实现基因的转移。所 以必须从大量的培养细胞中筛选出已被 外源DNA转化了的细胞，然后建立无性 繁殖系，使所需基因大量扩增和表达。
重组体的筛选 screening/selection 1. 直接选择法
三、DNA连接酶
在大肠杆菌和动物细胞中都发现了DNA连接酶，这种酶能够催 化DNA中相邻的 3’一OH和5’一磷酸基末端之间形成磷酸二酯键。 连接反应的最适温度是37℃，但在此温度下粘性末端之间氢键结 合很不稳定。实验表明，15℃对于连接反应和粘性末端氢键结合 的稳定性都是合适的。
四、甲基化酶
细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶(methylase) 米完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。 甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护DNA不被限 制性内切酶切开。真核生物中目前只发现5甲基胞嘧啶(M5C)。
(五) 动物病毒
动物病毒作为载体可用于外源基因向真核细胞的 转入。作为基因介导的动物DNA载体，必须具备以下 条件：(1)具有动物病毒的复制起始部位及启动子，以 便外源基因能有效的转染动物细胞，以及提供必要的 转录信号：(2)具有可供选择的标志基因，因为重建的 病毒转染力很低，一般仅为105 ～107 ，只有利用标志 基因才能选出转化细胞株；(3)具有适当的多种单一内 切酶位点供外源基因插入。 目 前 常 用 的 基 因 转 移 载 体 有 ： (1) 猴 空 泡 病 毒 (Simian virus 40简称SV40)；(2)腺病毒(Adenovirus)； (3) 乳 头 状 病 毒 (Papilloma virus) ； (4) 逆 转 录 病 毒 (Retrovirus); (5) 牛痘(Vaccinia)病毒; (6) 牛疣病毒 (Bovine papilloma virus)等。
（三）柯斯质粒载体（Cosmid vector）
柯斯质粒载体又叫粘粒载体，这是 一种由人工构建的含有DNA的cos序列和 质粒复制子的特殊类型的质粒载体。柯 斯质粒在结构组成上具有噬菌体的特性、 也具有质粒载体的特性和高容量的克隆 能力，一般可插入35～4基因的克 隆。
一、质粒载体(plasmid vector)
（1）质粒的一般性质 1．质粒的概念 质粒是细菌细胞染色体外存在 于细胞质中能进行自我复制的一类小型DNA分 子，大部分质粒为双链环状。 2．质粒的大小 3．质粒的拷贝数 4．质粒的不亲和性 5．质粒的宿主范围
质粒—存在于细菌染色体外的小型环状双 链DNA分子 理想的质粒 1.拷贝数多; 2.两三个抗药性基因 terr ampr 筛选标志 3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一）
三、获得目的基因的方法
(一)利用理化方法分离基因 理化方法分离基因是依据DNA双链结构 的特点和四种碱基互补的氢键差异，其 方法有以下四种： 1．密度梯度超速离心法 2．单链酶法 3．多聚赖氨酸法 4．分子杂交法
(二)利用生物学方法分离基因
利用噬菌体转染或质粒转化等微生物学技 术分离基因的方法，我们把它叫做生物学方法。 这种方法应用于原核基因的分离提取。 用 适 当 的 限 制 性 内 切 酶 (Restriction endonuclease )将整个染色体或DNA分子切成 许多相当于一个或略大于一个基因的片段，然 后把全部DNA片段与质粒组成重组DNA分子，并 转化到某特定基因营养缺陷型受体菌内，进行 纯系繁殖，再经分离鉴定，选出所需基因。
（四）YAC载体
YAC 是 酵 母 人 工 染 色 体 （ Yeast artificial chromosome）的缩写，是目前能容纳最大外源DNA片段 的载体。简单地说，酵母人工染色体载体有两个臂， 之间有着丝粒，每个臂的末端有一个端粒，另外，染 色体上还有供选择的标记基因；当外源DNA片段连接进 两个臂中以后，通过选择标记人们可以从酵母宿主细 胞中筛选出重组的人工染色体。 实验结果证明，每个YAC都可以装进100万碱基以上 的DNA片段，这种大小比柯斯质粒的装载能力要大数倍， 所以可以保证基因结构的完整性。
(三)基因的人工合成
1. 化学合成法 2. 逆转录法(Reverse transcription) 逆转录法也叫cDNA法，它是一种酶促合 成法，即以mRNA为模板，在反转录酶的 作用下，以四种脱氧核苷三磷酸为材料 合成DNA(cDNA)，再经复制后即成双链 DNA。 3. 聚合酶链式反应 (PCR)
• 基因克隆示意图
载体DNA (限制性内切酶切开) 目的基因
重组体
宿主细胞
已转化的宿主细胞
繁殖 阳性克隆株
表达
第二节 工具酶
常用的工具酶
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ 切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端
反转录酶
多聚核苷酸激酶 末端转移酶
cDNA合成
5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾
抗药性标志选择 标志补救 表达产物与营养缺陷互补 α—互补 蓝白斑筛选 分子杂交 探针 原位杂交 /Southern印迹法 限制性酶切图谱/PCR
2.非直接选择法 免疫学方法
七 克隆基因的表达 载体有转录、翻译的元件 密码子通用 1 、 原核表达体系 原核表达载体的标准 • 合适的筛选标志 • 强启动子 • 翻译控制序列 • 多克隆位点
融合蛋白 包涵体 大肠杆菌表达体系的不足 1. 缺乏转录后加工机制，只能表达 cDNA 2. 缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖 基化 3. 融合蛋白形成包涵体，复性后才有活 性 4. 很难表达大量的可容性蛋白
2 真核表达体系 筛选标志 Neor G418 转染方法
磷酸钙沉淀 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射
Eco RⅠ
Hind Ⅲ Bam HⅠ Sal Ⅰ
氨苄青霉素 抗性基因 Pst Ⅰ
pBR322
四环素 抗性基因
Ava Ⅰ
Ori
Pvu Ⅱ
（二）噬菌体载体( Phage vector)
噬菌体是一种温和噬菌体，由于它的遗 传结构和宿主大肠杆菌的遗传结构研究得比较 清楚，并能在细菌中大量繁殖，所以成为广泛 采用的载体。噬菌体还有一大优点，即使它 的DNA丢失25％仍不失活，这部分丢失的空档 正好可以装载外源DNA。 • 与质粒载体相比，λ 噬菌体作为载体可以克隆 更大一些的DNA片段，欲构件一个基因， 往往可以减少中克隆的数量。
二、转基因动物技术的一般步骤
(1)选择能有效表达的蛋白质； (2)克隆与分离编码这些蛋白质的基因； (3)选择能与所需组织特异性表达方式相适应的基 因调节序列； (4)把调节序列与结构基因重组拼接，并在培养细 胞或小鼠中预先检验其表达情况； (5)把拼接的基因注射到受精卵的细胞核中； (6)把注射后的受精卵移植到子宫，完成胚胎发 (7) 检测幼畜是否整合外源基因、外源基因的表达 情况以及外源基因在其后代中的传递情况。
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
限制性核酸内切酶 细菌限制修饰体系 限制性核酸内切酶 甲基化酶 识别特异的位点—酶切位点 Eco RⅠ 回文结构 4～6 bp GAATTC 出现两种末端 CTTAAG 粘性末端 粘端 Smal Ⅰ 平头末端 平端 CCCGGG 配伍末端 GGGCCC
二、DNA聚合酶
（一）DNA聚合酶I (全酶) (E. coli DNA Polymease) （二）K1enow片段(E.co1i) （三）T4 DNA聚合酶 (T4噬茵体感染的E．co1i) （四）Taq DNA聚合酶(Thermusaqraticus) （五）逆转录酶（reverse transcriptase） （六）末端转移酶
第七章 动物基因工程
第一节 基因工程概述
基因工程(Genetic engineering)是一种DNA重组技术，它 是在分子水平上进行的遗传操作，即把供体细胞中的 基因或基因组提取出来，按照预先设计的蓝图，经过 体外加工重组，或者把人工合成的基因转移到受体细 胞并获得新的遗传特性的技术。由于被转移的基因必 须与载体DNA重组后才能实现转移，所以基因工程也 叫做重组DNA技术。 基因工程的基本操作程序包括：(1) 目的基因的分离或合 成；(2)用工具酶对目的基因和载体（Vector）进行加 工处理，把目的基因与载体结合成重组DNA分子；(3) 把重组DNA分子引入受体细胞，并使目的基因和载体 上其他基因得以表达；（4）转化体细胞的扩增；（5） 重组体细胞的鉴定与筛选。