（1）转基因胚胎干细胞的获得 （2）囊胚注射 （3）嵌合体的检测和育种
胚胎干细胞基因转化法 (引自G1ick & Pasternak，1998)
判断是否是种系嵌合
首先用转基因嵌合体的小鼠与正常的小 鼠交配，对其后代进行检测，如果后代中 有转基因个体出现，证明为种系嵌合，然 后将转基因杂合子个体进行横交就会获得 转基因纯合子和杂合子个体。如果在后代 中没能发现转基因纯合子，应注意是否因 为转基因的纯合造成了胚胎的早期死亡， 无法得到成活个体所致。
转基因在基因组中的存在方式有两种，即随机整合和定点整
合。
为了达到外源基因的高效表达，在转基因结构上增加了含有
位点控制区（LCR）、核基质附着区(MAR)等调控元件，可 以实现插入位点非依赖性、拷贝数相关的表达模式。LCR和 MAR的功能不受种属差异的限制，无论外源基因插入什么 位点，都能够维持一个开放的染色体结构，有利于基因的表 达。
AAV具有以下几个方面特点：

非致病性、无免疫原性和无炎症反应 能感染静止期的细胞，如神经元细胞 插入的外源基因表达时间长，可达到1年之多 宿主范围广 热稳定性强，容易通过灭活辅助腺病毒纯化
（3）反转录病毒
反转录病毒是一种整合型单链RNA病毒，感染宿主 细胞后，病毒颗粒中的pol基因表达出反转录酶， 以单链的RNA基因组为模板，立即转录出一份线形 双链DNA复本，然后在整合酶（Int）介导下，整 合到宿主的基因组内，此时整和的病毒序列被称为 前病毒。 反转录病毒基因组整合到宿主细胞基因组后，其 DNA随宿主DNA的复制而复制，并由5`-LTR中的 一个强启动子转录出病毒RNA链，它既是病毒基因 组，同时又具有mRNA模板活性，翻译出结构蛋白 和反转录酶。在宿主细胞质中，两条相同的RNA链 和反转录酶被包装与内壳中，形成的成熟病毒颗粒 以芽植方式分泌至细胞外，但通常不致死宿主细胞。
（3）基因下调（knock-down）
RNA干扰（RNAi）又被称为基因下调，通过 干扰RNA（siRNA）分子的作用达到转录后基 因沉默的效应。 siRNA的制备方法主要包括体外合成siRNA和 siRNA表达载体两种。体外合成的siRNA易转 染细胞，进入细胞后，可直接发挥作用，一般 不存在siRNA 表达载体的转录效率低及细胞毒 性等问题。但是体外合成的siRNA 只能瞬间干 扰，不能达到长久抑制病毒的效果。
3、转基因体细胞核移植法生产转基因牛
基因的准备 供体细胞获取 卵母细胞的获得 体外成熟培养
传代培养、扩增
供体细胞的转基因
卵母细胞的去核
转基因供体细胞的筛选与扩增
核移植
获得转基因个体
胚胎移植
重构胚体外培养
步骤一：从一只６岁芬兰多塞特白面母绵羊（姑且称为Ａ）的乳腺中取出乳腺细胞，将 其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为“供体细胞”；步骤 二：从一头苏格兰黑面母绵羊（Ｂ）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除 去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为“受体细胞”；步骤三：利用电脉冲方法， 使供体细胞和受体细胞融合，最后形成“融合细胞”。电脉冲可以产生类似于自然受精 过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成 “胚胎细胞”；步骤四：将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（Ｃ）的子宫内， 胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊--多莉。
原病毒DNA转 染进包装细胞 中，包装原病 毒产生将病毒 RNA包装成感 染性病毒粒子 的所有蛋白质 ，但却不能包 装自身的RNA
逆转录病毒载体稳定、长期表达外源基因
第三节 转基因动物制备 转基因动物的制备程序 转基因鉴定 表达水平的检测 转基因动物传代与检测
一 转基因动物的制备程序
DNA显微注射法制备转基因小鼠 胚胎干细胞法制备转基因小鼠 转基因体细胞核移植法生产转基因牛
以山羊乳腺特性表达载体pBC1为例
2. 病毒载体
作为基因转移的病毒载体须具备以下基 本条件： 携带外源基因并能够包装成病毒颗粒 介导外源基因的转移与表达 对机体不致病
（1）腺病毒（adenovirus）
腺病毒作为转染载体有许多特点： 基因组的重排率低 外源基因与病毒DNA重组后能遗传几个周期 安全性好，不会整合到人的染色体上，不导 致肿瘤的发生 宿主范围广，对受体细胞是否处于分裂期要 求不高 外源基因在载体上容易高效表达
利用点穿孔法进行基因转移
（2）显微注射法 将外源DNA在显微镜操作系统的辅助下，通过 玻璃微管直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵 的原核内，使外源基因整合到基因组上，制备转 基因动物。 （3）基因枪法 基本原理是将要转染的DNA吸附到高黏度的金 属（钨或金等）颗粒上，在一种加速装置的作 用下，将这些粒子高速打入细胞或组织内，达 到转基因目的
1、从简单的显微注射法向高效率的 转基因体细胞核移植方向发展
从转基因的技术手段来看，除DNA显微注射法
外，人们先后试过反转录病毒载体介导法、精子 介导法、胚胎干细胞介导法和核移植法等多种转 基因方法。
转基因细胞的核移植技术已经成为转基因动物生
产的主流方法。
2、从外源基因随机插入(或整合)到定 点整合的转变
利用磷酸钙共沉淀法进行DNA转染
（2）脂质体法 （lipofection）
将待转染的DNA溶 液与磷脂混合，后者 在表面活性剂存在下 形成包埋水相DNA 的脂质体结构。当这 种脂质体悬液加入到 细胞培养液中，便会 与受体细胞膜发生融 合，DNA片段随即 进入细胞质或细胞核 内。
质脂体介导的基因转移
据路透社11月8日报道， 日本科学家已经培育 了一种新的基因改良 老鼠，它们不具备感 知危险气味的能力， 因此，对其死对手猫 一点都不觉得害怕， 相反还大胆地在猫身 上爬来爬去，甚至偎 依在猫身边。此研究 发表在7日出版的《自 然》杂志上。
文章的第一作者，东京大学 的Takashi Sakudoh说：“对 蚕的色素传输系统的了解， 使得我们有可能通过基因调 控来控制蚕丝的颜色和色素 比例。” 自然界中，蚕茧的颜色 有白色、黄色、稻草色、橙 红色、粉红色和绿色。丝绸 的颜色来自于桑蚕吃桑树叶 时对自然色素的吸收。
二 、基因转移技术
物理转染法 化学转染法 生物法
1. 物理转染法
（1）电击法（electroporation）其基 本原理是在外加电场的作用下，细胞膜 电位发生改变，细胞质膜瞬间出现可逆 性的电穿孔，从而使一定数量的外源 DNA从细胞外扩散到细胞质和细胞核内， 并进一步整合到宿主DNA上，达到转基 因目的。
转基因细菌可治癌症
英国医学专家日前将转基因大肠杆菌 与一种抗癌药相结合，成功杀死了实验鼠 体内的癌细胞。科学家将转基因大肠杆菌 注射到实验鼠的肿瘤内，再给实验鼠注射 一种名叫6－MPDR的抗癌药。这种药无 法单独发挥作用，但是一种由转基因大肠 杆菌分泌的酶能将此药物“激活”，形成 一种有效的毒素，将其周围的癌细胞杀死， 而不伤害其它组织器官。
（4）超声波法（sonoporation） 超声波增强基因转染法的主要机制是声 波的空化效应导致细胞的通透性增高， 而通过添加超生造影剂能降低空化域值， 增强空化效应，促进外源基因进入细胞， 提高基因的转染效果
2.化学转染法
（1）磷酸钙法 将待转染的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加 入CaCl2后，DNA片段与磷酸钙共沉淀并形成 大的颗粒；将此颗粒悬浮液加入贴壁培养的 细胞中，外源DNA就被靶细胞所吸收，进而 实现转基因。
（3）原生质体融合法
含有目的基因的质粒转化细菌或酵母细胞。 大量扩增，利用溶菌酶或蜗牛酶去除胞壁部 分，在高盐条件下制成原生质体，然后散铺 在单层培养的哺乳动物细胞上，在 融和剂 （如聚乙二醇）作用下，使染色体或质粒转 如细胞内，实现转基因
3.病毒感染法
构建含有选择性标记的反转录病毒基因组部分 DNA与质粒的杂合型载体分子，在多克隆位点插入 外源基因形成重组DNA分子，克隆到大肠杆菌中扩 增鉴定；重组DNA分子通过物理或化学方法转入一 个特制的病毒包装细胞系。转染入包装细胞系的重 组DNA转录出相应的重组RNA分子，包装细胞系分 泌出来的重组反转录病毒，便可感染其他类型动物 受体细胞，重组RNA分子以DNA形式整合到染色体 上，并表达外源基因。
第二节 转基因动物技术
一、动物基因工程载体 二、基因转移技术
一、动物基因工程载体
作为动物基因工程载体必须具备以下几个功能： 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力 为外源基因提供在受体细胞内复制或整合的能力 为外源基因提供在受体细胞内的扩增和表达能力
载体可分为: 质粒型表达载体 病毒载体 定向打靶载体
1、DNA显微注射法制备转基因小鼠
超数排卵
基因技术
2、胚胎干细胞法制备转基因小鼠
胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团中分离出的 未分化、具有正常二倍体染色体和发育全能性 的细胞。
优点：
可以在体外进行人工培养、长期扩增、冷冻保 存
胚胎干细胞制备转基因动物过程
（1）基因敲除
敲除型载体由两段与基因组内靶基因座序列同源的 DNA 片段（又称同源臂）组成，中间为正向选择标记， 同缘臂外侧为真核细胞中的负选择标记及在原核细胞 中进行复制与筛选的载体DNA序列。
（2）基因敲入
基因敲入是利用同源重组原理将外源基因插入到染色 体的特定位点上。基因敲入的转基因结构设计上相似 于基因敲除结构，但区别在于：或用外源基因替换并 失活靶基因、或在不影响拔基因功能的前提下插入新 的基因、或在染色体上特定位点插入新的外源基因， 从而实现基因转移，并使得外源基因高效表达
世界第一只转基因动物
世界首只转基因灵长类动物 ——-安迪
荧光鱼
转基因兔
转基因兔鼠
据英国媒体4日报道， 英国第四频道电视台将 在一个新的电视节目秀 中披露一个转基因动物 农场中的众多惊人内幕： 在那个农场中，绵羊长 着人心脏、山羊会吐蜘 蛛丝、奶牛尺寸是普通 牛的3倍大，而猪则会 在黑暗中发光！据英国 第四频道电视主任凯 文· 利戈称，他们拍摄 下来的农场中的所有转 基因动物，全都真实存 在，而非科幻电影中的 虚构场景。