赛润ELISA classic白色念珠菌IgG/IgM/IgA目录1.用途2. 诊断意义3. 赛润ELISA classic - 检测原理4.试剂盒组成5.检测所需物质，试剂盒未提供6.储存和稳定性7.赛润ELISA classic的检验步骤7.1 注意事项7.2 样品准备和储存7.3 试剂盒反应试剂的准备7.4 检测程序概要7.5 检测过程8. 检测结果评估8.1 4PL单点定量法8.2 检验有效性标准8.3 计算赛润ELISA classic白色念珠菌IgG/IgM/IgA（定量）8.4 检测结果分析9.性能特性9.1 重复性9.2 敏感性和特异性10.警告10.1警告和安全措施10.2废料处理11.参考文献V9.03/06-1赛润ELISA classic白色念珠菌IgG/IgM/IgA试剂盒用于人抗体(IgG/IgM/IgA)的酶联免疫检测- 体外诊断用-IgG试剂盒(定量) 编号: ESR117GIgM试剂盒(定量) 编号: ESR117MIgA试剂盒(定量) 编号: ESR117A检测评估标准: Dade Behring BEP ® III / BEP ® 2000, DSX, 手动操作1.用途赛润ELISA classic白色念珠菌IgG/IgM/IgA试剂盒主要用于定性和/或定量检测人血清或血浆中抗白色念珠菌的抗体。

由于细胞质和数量减少的细胞壁成份组成的复合抗原的存在，使得能够在浅表性和侵入性霉菌病感染的不同时期，进行抗念珠菌属抗体的检测，。

2.诊断依据白色念珠菌是属于类酵母真菌科的、普遍存在的一种酵母菌。

表1：具有医学相关性的真菌除了引起浅表性感染的酵母型之外，而所谓的假菌丝体是类酵母真菌的另一种形态学表现。

芽管和假菌丝体的产生主要发生在侵入性感染的病人体内。

念珠菌属酵母菌能够产生和分泌多种酶，使兼性病原体微生物能够穿透血管和粘膜屏障。

念珠菌属各种病菌一般是通过污物的污染进行传播的，主要的入口是鼻咽通道，但脂肪酸、酸性pH值和敌对性菌群等也会引起皮肤表面抑制真菌感染的功能障碍，从而导致浅表性的念珠菌病。

病菌感染粘膜后，侵入性的霉菌病会从胃肠道向外传播。

类酵母真菌对不同上皮粘膜的附着是通过粘附蛋白和外部细胞膜细微结构的差异来实现的，下面流程图描述了重度感染病人体内引起感染传播扩散的（假设性）过程：图1：念珠菌的感染过程念珠菌属的细菌不属于健康人群生理活动的微生物菌群，但可以观察到它对人类宿主的普遍感染。

念珠菌病根据下面的主要特征可分为两大类：表2：念珠菌感染的特征念珠菌属感染的血清学诊断是很困难的，一方面酶母菌短时间的定植会引起免疫反应，另一方面在免疫抑制病人体内，系统性的念珠菌性霉菌病可能只会引起低活性的免疫应答。

对于这些病人血清学检测的必要性，要做明确的解释。

此外系统性的念珠菌感染没有典型的临床症状。

目前不同试验系统对念珠菌抗体的检测结果还不具有可比性及可转换性，抗体检测的特异性明显取决于所采用的试验系统（ELISA或HAT）或抗原制备过程，用HAT试验检测IgM抗体高于IgG，因为IgM具有更强的凝集能力。

HAT主要用于检测抗类酵母真菌细胞壁抗原的抗体，从而进行血清学解释，而对于更复杂的情况仅提供了鉴别诊断的机会。

抗体滴度的变化可以用ELISA试验来检测，而HAT无法检测，因此两种检测方法应该联合使用，尤其是针对IgM抗体活性降低而同时IgG抗体增加的情况。

目前还没有哪一种检测技术能够在念珠菌感染的血清学诊断单独使用，对于高危人群的监测和治疗控制最好是几种血清学检测方法联合使用。

3.赛润ELISA classic - 检验原理用抗原包被微量板孔，制成固相载体。

加患者血清到板孔中，其所含的抗体特异性地与固相载体中存在的抗原结合，形成免疫复合物。

除去多余物质后，加入碱性磷酸酶标记的IgG、IgA和IgM抗体，使之与上述免疫复合物反应。

洗板，除去多余的结合物，加入底物（对硝基苯磷酸盐）。

该反应产生有颜色产物，颜色强度与特异性抗体含量成正比。

4.试剂盒的组成5.其它检测所需物质- 普通实验室所需的仪器装置- IgM检测: 赛润类风湿因子Rf -吸附剂（产品编号Z100/5ml和Z200/20ml）- 分光光度计，波长405纳米，建议参考波长范围620纳米- 690纳米（例如650纳米）- 37℃温箱- 湿盒- 蒸馏水。

6.储存及稳定性7.赛润ELISA classic的检验步骤7.1注意事项只有全部使用赛润ELISA classic试剂才能保证检测效果，因为所有试剂都是有关联的，不能混用其他制造商的产品。

尤其是标准血清，对照血清以及酶标记物，必须使用试剂盒配备的，不要使用其它批号产品。

稀释缓冲液，洗液，终止液和底物溶液可用于所有赛润ELISA classic试剂盒。

ELISA classic试剂盒内所有试剂均必须正确地存放。

应在未开封的情况下，保存于2-8℃，并在有效期（见标签说明）内使用。

详细的稳定性和储存资料在“6. 储存及稳定性”内将加以详述。

每一种试剂都是经过校准以保证最佳的检测结果。

这些试剂如果未经规定被稀释或改动都会导致检测的敏感度的降低。

在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。

所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。

应按照规定刻度截断微孔条。

如果铝袋破损或者开启装有干燥剂的铝袋后而未以夹子封紧的，则不要继续使用。

开始试验前，将所有试剂置于室温。

从试剂管中吸取试剂的时候，应注意使用无菌技术以防污染。

为避免假阳性结果，吸加酶结合物时，吸嘴应确保不接触或喷洒于小孔的外面，注意不要盖错瓶盖或管盖。

试验结果的可重复性依赖于充分混合试剂。

使用前振荡装有对照血清的小管和所有稀释过的溶液（例如使用混合器）。

小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。

请注意在吸取标本 / 对照血清，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。

只有严格遵守赛润ELISA classic试剂的试验说明才会得到最佳的检测结果。

如果实验中未严格遵守控制质量控制认证文件上的有效性特异准则，则试验结果无效。

洗涤不充分将影响试验结果：应该小心进行洗涤。

洗涤步骤应遵守相关洗涤器（平底孔，孔直径7毫米，深10.9毫米）指导手册进行。

重要的是所有的孔内均应加入相同体积的洗涤缓冲液。

洗涤结束时，应将微孔板倒扣于纸巾上并轻轻敲打，以确保所有孔内均无洗涤缓冲液。

避免产生泡沫！如果使用自动洗板机，注意正确操作。

7.2 样本准备储存虽然，在检验中不会产生副影响，但为避免干扰结果，应保留使用高血脂的、溶血的或污染的血清。

样品不应加热灭活。

7.2.1样品稀释开始试验前，患者的待测样品必须以稀释缓冲液稀释如下（V1+V2）：赛润ELISA classic白色念珠菌IgG/IgA稀释后及加入微孔板前，样品必须充分混合。

赛润ELISA classic白色念珠菌IgM类风湿因子干扰类风湿因子抗体是IgM的自体抗体，可与IgM免疫复合物结合。

非特异性IgM 抗体（风湿因子）的存在将导致IgM检测的假阳性结果。

另外，也存在弱结合的病原体特异性IgM抗体被强结合的IgG抗体取代的可能性。

在这种情况下，IgM的检测将得到假阴性的结果。

因此，在进行IgM检测前应用类风湿因子吸附剂对血清作预处理。

（赛润类风湿因子吸附剂，产品编号Z100 (5ml/25样品)及Z200（20ml/100样品））。

首先应该使用稀释缓冲液(V2)对类风湿因子吸附剂(V1)进行如下稀释：然后将患者的待测样品(V1)在此Rf-稀释缓冲液(V3)中进行稀释：7.2.2样品储存密封的患者样品可在冰箱中2-8℃保存7天。

≤ -20℃可保存更久。

避免样品反复冻融。

已稀释的样品可在2-8℃保存一星期。

7.3试剂盒反应试剂的准备7.3.1微孔条微孔条置于一框架内，并与干燥剂一同封于铝袋之中。

应将不需要的微孔条取下并重新放入铝袋。

将袋口折叠2-3次，并以夹子夹紧，确保铝袋的密封性。

7.3.2对照血清/ 标准血清对照和标准血清稀释，可直接使用。

对于每次试验和每批检测体系，无论使用的微量板数目的多少，均应包括阴性阳性对照孔。

界定对照应作双份。

如果定量试验，标准血清也应作双份。

不要用Rf-吸附剂处理对照血清！7.3.3抗人IgG, IgA或IgM抗体，用AP标记（即用）禁止将不同试剂盒的酶标抗体混合使用。

同一试剂盒才能达到最佳检测效果。

7.3.4洗液以1：30稀释浓缩洗涤缓冲液（V1）至体积V2。

例如：7.3.5样品的稀释缓冲液（即用）7.3.6底物（即用）试验时戴手套以避免污染。

必须以无菌针头吸取底物溶液。

7.3.7 终止液（即用）7.4检测程序概要白色念珠菌IgG / IgM/ IgA定量进行IgM检测时先吸除RF 因子样品稀释液（患者样本）IgM:1+100IgG/IgA:1000↓将稀释的样本，和立即可用的对照血清 / 标准血清，加到微量孔内（100微升）↓↓洗涤↓加入已稀释的酶标记抗体溶液（100微升）洗涤↓加入底物溶液（100微升）↓↓加入终止液（100微升）7.5检测过程7.5.1将检测所需数目的微孔条放到微孔板框上并准备好一张标签。

7.5.2在微量孔内分别加入100微升的已稀释样本对照血清。

留一个孔为底物空白使用，例如：7.5.3将样品于湿盒内37℃（± 1℃）孵育60分钟（± 5分钟）。

7.5.4 孵育后以洗液缓冲液洗涤板孔（使用自动洗板机或手工洗板）：- 吸去或甩去洗液- 每孔内加入300微升洗液- 吸去或甩去洗液- 重复洗涤过程3次（共4次！）- 将微孔板翻转过来在纸巾上拍打，使微孔中不再含有液体7.5.5 加入酶标记抗体。

于相应孔内（底物空白除外）加入100微升IgG / IgM / IgA酶标记抗体7.5.6湿盒内37℃（± 1℃）孵育30分钟（± 1分钟）*。

7.5.7孵育后，以洗液清洗板孔（洗涤见上）7.5.8加入底物于每孔内加入100微升底物溶液（包括底物空白孔）7.5.9 湿盒内37℃（± 1℃）孵育30分钟（± 1分钟）*。

*注意：在特殊的工作环境下有必要对孵育时间进行调整。

7.5.10终止反应每孔内加入100微升终止液，轻微振荡微孔板以混合溶液。

7.5.11读取消光度以底物空白为空白对照液，60分钟内读取405纳米的OD值，建议参考波长范围为620纳米-690纳米（例如650纳米）。

8．检测结果评估赛润ELISA classic白色念珠菌IgG/IgM/IgA（定量）8.1 4PL单点定量法用赛润ELISA classic试剂检测，抗体浓度可通过逻辑对数模型（4PL, 4个参数）来计算，该模型对浓度曲线有很精确的适用性。