含义：人工制造一个小室，将单细胞接种 在小室的微量培养基中。
用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形 成细胞团的过程。
特点：在培养过程中可以连续进行显微观
察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞
团的全部过程记录下来。
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微室培养的方法
先将先由愈伤组织培养诱导，经液体培养基
培养制得单细胞悬浮液备用。在无菌条件下，
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4.3.1 花药培养
4.3.1.1 花药材料的选择
选择大致处于所需要时期的花蕾。由于 花粉发育时期和植株的某些外部形态特征 之间的大致相关性，因此利用这些外部标 志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花 粉发育的准确时期。
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4.3.1.2 培养基的选择
花药培养所采用的培养基是MS、N6、
第4章 植物组织培养拓展技术
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4.1 细胞培养
细胞培养是将从植物的培养物游离的 细胞或细胞团，在人工培养基上进行的培 养的方法。通过细胞继代培养，使细胞不 断增殖，还能使高等植物的单个细胞经过 离体培养后细胞分裂形成细胞团，再经过 细胞分化最后产生完整的植株。
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4.1.1 单细胞的分离
4.1.1.1 机械分离
先将植物叶片取下经过无菌处理后，在研钵
中轻轻研碎，经过一定孔径的纱布或不绣钢 滤网过滤，取出过滤后的研磨介质经过低速 离心等其他处理使细胞得到纯化。
4.1.1.2 酶解分离
用纤维素酶和果胶酶等酶液处理适合植物外 植体即可得到所需要的单细胞。
4.1.1.3 由组织培养物分离
离体培养的愈伤组织分离单细胞。
含义：连续培养过程中，不断注入新鲜培 养基，排掉等体积的用过的培养基，培养 液中的营养物质得到不断补充。
目的：连续培养是植物细胞培养技术中的 一项重要进展，它对于植物细胞代谢调节 的研究，对于决定各个生长限制因子对细 胞生长的影响，特别是对于次生物质的大 量生产等具有一定意义。
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4.1.3.3 细胞悬浮培养的应用
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4.1.3 细胞悬浮培养
细胞悬浮培养是将游离细胞或细胞团 按一定密度，悬浮在液体培养基中不断地 搅拌或振荡培养，可以使培养细胞快速大 量增殖。
4.1.3.1 分批培养
含义：分批培养是指将一定量的细胞或细胞团
分散在一定量的液体培养基中进行培养。
目的：建立单细胞培养物。
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4.1.3.2 连续培养
后是核融合。
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4.3 花药和花粉培养
植物的花粉:是花粉母细胞经减数分裂形 成的，其染色体数目只有体细胞的一半， 叫做单倍体细胞。
花粉和花药的培养:是指花粉在培养基上 改变其正常发育和机能，不经受精而发 生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整 植株的技术。
单倍体植物：用离体培养花药的方法使 花粉发育成一个完整的植株。
含义：把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混 合，并平铺一薄层(1mm)在培养皿底上的培 养方法。
用途：是为了分离单细胞无性系，研究其生理、 生化的遗传上的差异而设计的一种单细胞培 养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合 产物的培养。
特点：可以定点观察；分离单细胞系比液体浅 层培养容易；培养细胞气体交换不畅。
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4.2.2 原生质体的培养
4.2.2.1 固体培养法
将悬浮在液体中的原生质体悬液与热融 的含琼脂的培养基等量混合，使琼脂的最 终浓度为 0.6％左右，冷却后原生质体包 埋在琼脂培养基中。
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4.2.2.2 液体培养
在培养基中不加凝胶剂，原生质体悬 浮在液体培养基中。
4.2.2.3 固液结合培养法
悬浮培养的单细胞系是突变体育种的良好材 料；
人工种子和快速繁殖上的应用； 种质保存当中的应用； 遗传转化的良好受体，转基因技术的应用； 工业方面一是生产植物次生代谢产物，二是
用于生物转化，得到期望的天然化合物。
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4.2 原生质体培养
原生质体培养的意义：
（1）在植物遗传育种实践方面意义重大。
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看护培养的方法
（1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培 养基，灭菌后备用。
（2）无菌条件下，将一小块活跃生长的愈伤 组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放 一片已灭菌的滤纸，然后放置一个晚上。
（3）将分离的单个细胞接种到培养基的滤纸Байду номын сангаас上。
（4）恒温培养。
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4.1.2.2 微室培养法
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机械分离法和酶解分离法的比较
机械法
1. 细胞不受到酶的伤害； 2. 机械法不用质壁分离； 3. 细胞产量低； 4. 细胞易破。
酶解法
1. 细胞受到酶的伤害； 2. 要质壁分离； 3. 细胞产量高； 4. 细胞不易破。
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4.1.2 单细胞的培养
4.1.2.1 看护培养法
含义：用一块活跃生长的愈伤组织块来看 护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 用途：诱导形成单细胞系。 要求：看护愈伤组织处于活跃生长状态； 愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个 物种也可以不同。
在培养皿的底部先铺一薄层含凝胶剂 的固体培养基，再在其上进行原生质体 的液体浅层培养。
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4.2.3 细胞融合
4.2.3.1 融合方式
主要是用各种化学试剂作为诱导剂，常
用的方法有高钙高pH法、聚乙二醇 (PEG)法。
4.2.3.2 融合过程
异种原生质体先经膜融合形成共同的质
膜，然后经胞质融合，产生细胞壁，最
按盖玻片大小在无菌载玻片上涂一圈四环素眼
药膏。将制得的单细胞悬浮液中取出一滴3ml只
含一个单细胞的培养液，滴在圈内的载玻片上，
然后在药膏上放一小段已消毒的毛细玻璃管，
将无菌盖玻片盖在涂有一圈药膏的载玻片上，
轻压使其与药膏紧密接触，使盖玻片与载玻片
之造成一密封的小室。
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4.1.2.3 平板培养法
（2）由于没有细胞壁，有利于进行体细胞诱导 融合和单细胞培养。
（3）可用于细胞表面的结构与功能的研究，细 胞器结构与功能的研究，病毒侵染与复制机理的 研究，细胞核与细胞质相互关系，植物生长物质 的作用、植物代谢等生理问题的研究。
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4.2.1 原生质体分离
材料的选择： 叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞 材料，取生理状态适宜的叶片，有利于 原生质体的细胞再生和细胞分裂。 酶： 分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、 半纤维素酶和果胶酶。