A.阳性对照
B.阴性对照
C.原位检测mRNA表达
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（四）mRNA 含量分析
1．反转录PCR（RT-PCR）
逆转录酶 DNA聚合酶
mRNA 杂化双链 cDNA
PCR扩增
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（四）mRNA 含量分析
1．反转录PCR（RT-PCR）
RT-PCR用于对表达信息进行检测或定 量。另外，还可以y(A)的mRNA。
ddH2O
pH值适当，避免污 染
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA 的微量分析 （四）mRNA 含量分析
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（一）目的基因的克隆
①利用特异性引物，以cDNA或基因 组DNA为模板获得已知的反应相结合， 直接从组织和细胞的mRNA获得目的基 因片段。该方法被称为RT-PCR技术。
适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（三）DNA 的微量分析
原位PCR的作用
既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交 （ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于 10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标 准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度 很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。
内参照RNA必须使用与样品RNA同样的引物 识别序列，但是产物的大小不同，可以在电泳时 区别开。
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（四）mRNA 含量分析
3．荧光实时定量 PCR（real time PCR) 根据PCR反应动力学特点设计，通过荧光染料
DNA模板
纯度 蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物
浓度 浓度适当（一般100ngDNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加）
引物
设计 引物3＇端为关键碱基；5＇端无严格限制。 合成质量
浓度 50uL体系引物加量为10～20 pmol
（五）反应体系对PCR扩增的影响
30轮循环
（2）特异性
扩增量达230个拷贝（109拷贝）
•引物的序列及其与模板结合的特异性 是决定PCR反应结果的关键。 •引物设计的最大原则是最大限度地提 高扩增效率和特异性；同时尽可能减 少非特异性扩增。
（三）PCR技术的特点
（3）操作简便易行
PCR扩增法,只需要数小时,就可 以用电泳法检出1μg基因组DNA 中仅含数个拷贝的模板序列。
2．巢式PCR 巢式PCR(nested PCR)也称做嵌套式PCR， 主要作用是提高了目的基因获得的灵敏度和特异性。它是通 过设计两对引物，一对引物对应的序列在模板的外侧，称外 引物(outer-primer。)，另一对引物互补序列在同一模板的 外引物的内侧，称内引物(inter-primer)。外引物扩增的产 物较长，含有内引物扩增的靶序列。首先用外引物进行PCR 反应，获得的产物再利用一对内侧引物进行第二次PCR反应。
specific amplification sequence, or 8bp continuous complementary base
（四）PCR标准反应体系
Primer designed with the help of computer
DNA database conservative region comparision Primers or Blast
dNTP 耐热聚合酶：1969年，美国黄石国家公园温泉； 94KDa；活性：在几种水生栖热菌中活性最高， 200 000U/mg 。1988年引入了PCR技术
ddH2O
（四）PCR标准反应体系
DNA模板：纯化的基因组或质粒DNA；
由RNA转化得到的cDNA； 未经纯化的粗制生物样品（细菌 克隆或噬菌斑 ）
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（一）目的基因的克隆 1．反转录PCR RT-PCR是将RNA反转录和PCR结合起来 建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA，然后以 cDNA分子为模板,在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复 制的机制，使目的cDNA片段得到扩增。由于PCR反应的高 度敏感性，从少量的RNA样品，甚至不用进行mRNA的纯 化，就可以获得目的基因。
Mg 2＋浓度
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂； 0.5mmol/L～2.5mmol/L反应体系； Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性； Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度会影响反应中游离的Mg2+浓度。
dNTP Mixture
生物化学暨分子生物学教研室 关亚群
PCR技术的创建
• Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性, 与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆 DNA的设想。
• 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代 基因工程技术的发明使克隆基因成为可能， 所以，Khorana的设想被人们遗忘了……
1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设 想得到实现。

一、PCR技术的基本原理
（一）基本概念
Polymerase chain reaction，PCR
即聚合酶链反应。是以拟扩增的DNA 分子为模板，以一对分别与模板5＇末端 和3＇末端互补的寡核苷酸片段为引物， 在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复 制的机制，使目的DNA片段得到扩增的 技术。
一、PCR技术的基本原理
（二）基本原理 无细胞分子克隆法： 变性--退火--延伸三个步骤 模板DNA的变性：93℃～95℃左右， 模板DNA与引物的退火(复性)：
Ta=Tm–3～5 ℃ 引物的延伸：Taq DNA聚合酶之5＇→
3＇DNA聚合酶活性
一、PCR技术的基本原理
（二）基本原理
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（三）DNA 的微量分析
原位PCR(In situ PCR)
是由Haase等于1990年首创。它是利用完整 的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的 目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定 的检测手段来检测细胞内的扩增产物。
直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细 胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。
（4）用途广泛
生命学科 医学工程 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学
（四）PCR标准反应体系
DNA模板： 引物 ：引物确定了扩增产物的序列和长度 反应缓冲液： 10-50mmol/L Tris-HCl
(pH8.3-8.8, 20℃) Mg2+：for Taq polymerase activity
预变性
94
温
度 72
（℃）
55 22
1
2
3
高温变性 低温退火
与引物复性
子链延伸 DNA加倍
DNA双螺旋
重复1-3步 25-30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
（三）PCR技术的特点 （1）高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍
IS-PCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊 断中一种崭新的检测技术。该法在检测细胞内病 毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA 表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜 在感染方面也具有重要意义。
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（三）DNA 的微量分析 操作步骤
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般 PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入； 2. PCR扩增细胞内目的片段； 3. 原位杂交检测扩增产物。
（四）PCR标准反应体系
Taq DNA聚合酶
离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较敏感。 最适浓度为50mmol/L。
忠实性: 没有校正单核苷酸错配功能———致命弱点。 一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环， 利用PCR克隆、测序时尤应注意。
抑制剂: 尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS• 及许多其他化学药剂。
酶：逆转录酶和DNA聚合酶 引物：随机引物、oligo(dT)或基因特异 性的引物（GSP）起始。 RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（四）mRNA 含量分析
2．竞争性RT-PCR
竞争性定量PCR(competitive quantitative PCR)技术是在反转录反应前，在 反应系统中加入外源性标准品RNA作为内参照。 这一标准品RNA与样品RNA同时经历RT-PCR 反应，根据已知浓度的标准品RNA的反转录和 PCR反应效率，计算出处于同一反应中的样品 RNA含量。
dNTP浓度取决于扩增片段的长度； 四种dNTP浓度应相等，避免反复冻融； 浓度过高易产生错误碱基的掺入， 浓度过低则降低反应产量； dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降, 影响 DNA 聚合酶的活性。
（五）反应体系对PCR扩增的影响
反应Buffer pH、盐离子、稳定剂、
增强剂 提供缓冲环境
内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的 原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源 的DNA。在使用扩增保守序列的通用引物， 会在无模板对照管出现扩增带。
保存: 在-20℃至少6个月
（四）PCR标准反应体系
PCR optimization
变性温度和时间： 92～95℃，富含G和C的序列，可适当提 高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。 退火温度与时间
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术