三,操作步骤 2.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 2.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 按照如下体积向PCR 并混匀: 并混匀:
10 X Buffer 10 X P1 10 X P2 25 L 10X T 10 X E 水 2.5 L 2.5 L 12.5 L 2.5 L 2.5 L 2.5 L
3.PCR扩增程序: 3.PCR扩增程序: 扩增程序 94℃
94 ℃ 55 ℃ 72℃ ℃ 72℃ ℃ 4℃ 5-10min(预变性) (预变性) 30S 30S 30S 5-10min(后延伸) (后延伸) 保温 30Cycles
屏幕显示方式
Main
运行已 有程序 已有程 序菜单 删除已 有程序
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Control BLOCK
PCR1 Method Sim-Tube
BLOCK:屏幕显示样品 屏幕显示样品 台温度(样品台温控方式 样品台温控方式) 台温度 样品台温控方式 Sim-Tube:屏幕显示反应 屏幕显示反应 液温度(模拟管温控方式 模拟管温控方式) 液温度 模拟管温控方式
Enter
耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus) DNA聚合酶(thermus 酶 活 性 (%) (%)
100 80 60 40 20 温度(℃ 温度 ℃)
40 50 60 70 80 90 100 Saiki(1988)将耐热 ( 聚合酶引入PCR,使利用热变性解链 模板可行. )将耐热DNA聚合酶引入 聚合酶引入 ,使利用热变性解链DNA模板可行. 模板可行
Kary B. Mullis
体内DNA的复制体系
5' 3'
拓扑异构酶 解旋酶类 SSB
DNA聚合酶 DNA聚合酶(I 引物 dNTP Mg2+
II III) III)
Mullis的PCR构思 Mullis的PCR构思
引物
DNA聚合酶 DNA聚合酶
DNA聚合酶 DNA聚合酶
引物
特定DNA片段 特定DNA片段
(5) Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂.浓度为0.5-2.5mmol/L. Mg2+是DNA聚合酶的激活剂.浓度为0.5-2.5mmol/L. 聚合酶的激活剂 0.5 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失,PCR产量下降; Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失,PCR产量下降; 浓度过低会使Taq酶活性丧失 产量下降 Mg2+过高影响反应特异性. Mg2+过高影响反应特异性. 过高影响反应特异性 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP,EDTA等 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP,EDTA等 可与负离子结合 dNTP 的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度. 的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度. Mg2+浓度
循环内第一步温度和时间
Step #1 Option? No yes ? Step #2 55.0C Hold 0m40s Step #2 Option? No yes ? Step #3 72.0C Hold 0m30s
不需要拓展功能
循环内第二步温度和时间
不需要拓展功能
循环内第三步温度和时间
Step #3 Option? No yes ?
内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen)
SYBRSYBR-Green I
Excitation
SG
5' 3'
SG
Emission
Run List File
Enter Edit Lid
新建反 应程序 编辑已 有程序 热盖关 闭调节
Enter
Enter abcdefghi#
jklmnopqr# Name #stuvwxyz# In Use! .,-+/():=#
输入文件名,满 个字 输入文件名 满8个字 符自动生成程序名,不 符自动生成程序名 不 个字符时用#终止 满8个字符时用 终止 个字符时用
PCR1 Segment #1 Hold Cycle END
选择预变性保温
Enter
Hold Hold
PCR1 at 94C for 5m0s
预变性温度和时间
Enter
PCR1 Segment #2 Hold Cycle END
循环参数设置
3
step
PCR
循环内步骤数
Step #1 94.0C Hold 0m30s
生物化学实验技术
目
PCR的反应原理 PCR的反应原理
录
PCR的类型和应用 PCR的类型和应用 PCR示例 PCR示例
多聚酶链式反应
(PCR:Polymerase Chain Reaction) PCR:
PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种 是由美国科学家穆利斯提出的一种 是由美国科学家 体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA 体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA 快速扩增的方法,此技术获得1993年诺贝 快速扩增的方法,此技术获得1993年诺贝 尔化学奖.
A.阳性对照
B.阴性对照
C.原位检测mRNA表达
荧光定量 PCR(real-time PCR)分析基因表 PCR(realPCR)分析基因表 达水平
通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针, 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对 PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合 PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程, 产物进行标记跟踪 相应的软件可以对结果进行分析, 相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初 始模板量. 始模板量.
未知序列
已知序列
未知序列
限制酶 未知序列 已知序列 连接酶 未知序列
限制酶
梯度PCR仪 仪 梯度
实时荧光定量PCR仪 仪 实时荧光定量
普通PCR仪 仪 普通
二,实验材料,仪器和试剂 实验材料, 材料: 0.3Kb插入片段的克隆载体 1,材料:含0.3Kb插入片段的克隆载体 2,仪器:微量移液器及吸头,PCR仪及PCR管 仪器:微量移液器及吸头,PCR仪及PCR管 仪及PCR 琼脂糖凝胶电泳设备 3,试剂:10XPCR 反应缓冲液 试剂: 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1和引物2 10μ 引物1和引物2
PCR反应循环 反应循环
94℃
变性
55℃
退火
72℃
延伸
PCR循环 PCR循环
5' 3'
变性, 变性,退火
引物
延伸
3' 5'
变性,退火 变性,
延伸
变性,退火 变性,
延伸
PCR的指数扩增( PCR的指数扩增(2n) 的指数扩增
PCR反应体系 PCR反应体系
模板:DNA 模板: 引物: 引物:P1 +P2 DNA聚合酶:TaqE 聚合酶: 聚合酶 原料: 原料:dNTP 反应缓冲液10xBuffer 反应缓冲液 辅助因子:Mg2+ 辅助因子:
设置反应完后的保温温度 和时间
Segment #5 Hold Cycle END Enter PCR1 Estimated Run Time: : 1h53m05s Save? YES no ?
终止参数设置
预计反应时间,程序是否 预计反应时间, 保存
Lid
LID Turn off heated Lid below 9C
mRNA 逆转录酶 杂交双链
DNA聚合酶 DNA聚合酶 cDNA
PCR扩增 PCR扩增
原位PCR分析基因表达的组织特异性 原位PCR分析基因表达的组织特异性 PCR
细胞或组织固定: 1. 细胞或组织固定 : 细胞经固定和乙醇通透化处理 后便适于一般PCR试剂(包括引物和Taq PCR试剂 Taq酶 后便适于一般PCR试剂(包括引物和Taq酶)进入 PCR扩增细胞内目的片段 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检 4 + (A+T)x 2 ( ) )
(1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源 1)序列应位于高度保守区, 序列. (2)引物长度以15-40 bp为宜. )引物长度以15- bp为宜. (3)碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%. 碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%. (4)引物内部避免形成二级结构. (5)两引物间避免有互补序列. (6)引物3'端为关键碱基;5'端无严格限制. )引物3 端为关键碱基;5
2)循环参数 (1)变性 (1)变性 使双链DNA解链为单链 使双链DNA解链为单链 DNA 94℃ 30-60秒 94℃, 30-60秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定. 温度由引物长度和GC含量决定. GC含量决定 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合; 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降 低温度可增加反应的灵敏性. 低温度可增加反应的灵敏性.
Taq
P2
P1 Mg2+ dCTP dTTP dATP dGTP
PCR反应条件 1)PCR反应成分 PCR反应成分
(1)模板 双链DNA均可. DNA均可 单,双链DNA均可. 不能混有蛋白酶,核酸酶,DNA聚合酶抑制剂,DNA 不能混有蛋白酶,核酸酶,DNA聚合酶抑制剂, 聚合酶抑制剂 结合蛋白类. 结合蛋白类. DNA模板一般100ng /100 DNA模板一般100ng /100L. 模板一般 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加. 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加.