《植物组培快繁技术》
康乃馨植物组织培养
实
验
设
计
小组成员：陈梅20141641044
郑莉20141641002
雷雨田20141641043
康乃馨植物组织培养
一、实验目的
掌握植物离体快速繁育原理、方法和完整过程。
二、实验原理
香石竹（学名Dianthuscaryophyllus）又名康乃馨，花色艳丽，开花时间长，装饰效果好，是世界上最畅销的切花之一，具有较高经济价值。
由于病毒病侵害，常使植株矮化，花朵变小，花色产生斑点，退色甚至不开花，影响切花产
量和质量。
通过茎尖分生组织培养，能够获得“无病毒”的健康植株，对于引
进的少而新的脱毒种苗，再进行一次茎尖培养，进一步降低基础苗中的病毒含量，并通过组织培养的方法快速繁殖，在短期内，就可以获得大量的脱毒试管苗，使引入材料迅速在生产上推广应用，取得明显的经济效益。
三、实验仪器与材料
仪器：超净工作台、酒精灯、电炉、烧杯、玻璃棒、镊子、解剖刀、接种盘、
纱布、记号笔、标签纸
试剂：75%乙醇、0.1%升汞、无菌水、MS培养基、IAA0.1mg/L、BA0.5mg/L、pH5.8-6.0、蔗糖、琼脂
材料：康乃馨带芽外植体材料
四、实验步骤
（一）培养基的配方
1、康乃馨的生芽培养基
MS+IAA(0.1mg/L)+BA(2.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)+蔗糖30g/L+琼脂(8g/L)
pH5.8-6.0,配制300ml,用培养瓶分装10~15瓶。
另外需要制备无菌水10瓶，培养瓶每人3~4瓶。
纱布、碟子若干，后二者分别用报纸包好一同灭菌。
2、康乃馨的继代培养基
MS+BA(0.3mg/L)+NAA(0.2mg/L)+蔗糖30g/L+琼脂(8g/L)，pH5.8-6.0,配制300ml,用培养瓶分装10-15瓶。
另外需要制备无菌水10瓶，培养瓶每人3-4瓶。
纱布、碟子若干后二者分别用报纸包好一同灭菌。
3、康乃馨的生根培养基
MS+生根培养基为1/2MS+NAA(0.075mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(8g/L)，
pH5.8-6.0,配制0.3L，用培养瓶分装10-15瓶。
另外，需要制备无菌水10瓶，每人3-4培养瓶、纱布、碟子若干后二者分别用报纸包好一同灭菌。
（二）康乃馨的生芽培养
1、无菌操作准备
将培养基、无菌水、及各种接种用具放入超净工作台，开紫外灯照射消毒20-30min,开送风开关，关紫外灯，通风10min后，打开照明日光灯。
洗手、换鞋，换实验服，戴口罩，进入接种室，开启超净工作台。
用纱布吸取75%酒精擦手、擦拭超净台、擦拭培养基和无菌水瓶，点燃酒精灯，镊子、解剖刀、剪刀等接种工具放入灭菌锅灭菌，待冷却后使用。
2、外植体消毒
选取康乃馨叶腋间生出的侧芽为外殖体，用自来水冲洗半小时，将材料上的泥土和灰尘及杂质冲洗干净，用解剖刀切取所需组织放入大烧杯中，用75%的酒精浸泡消毒30s，用无菌水冲洗3次，再将材料移入0.1%升汞溶液浸泡10分钟,然后在超净台内用无菌水冲洗6次。
材料消毒完成。
3、外植体的制备
将消毒好的材料用无菌滤纸吸去多余的水份,然后在无菌超净工作台上的接种盘内，借助解剖刀剥离茎尖，剥取茎尖大小通常在0.3mm左右。
以上操作均
需在酒精灯火焰旁进行。
4、外殖体接种
用灭菌过的镊子将切好的外植体接种到配置好的接种培养基上，每瓶接2-3块，每人至少三瓶，可以更多一些。
接种培养基为
MS+IAA0.1mg/L+6-BA0.5mg/L,PH5.8,蔗糖3%,琼脂0.75%。
接种完成后盖上瓶盖。
贴标签，注明材料名称、接种日期和姓名。
5、培养与观察
将培养瓶表面用酒精擦拭消毒置于培养室培养。
整理、清洁超净工作台。
康乃馨的培养条件为温度25±1℃,一昼夜光照16h,光照强度2000lx。
经过10天左右的培养,大部分茎尖开始萌动,逐渐长大,20天左右即可长成一小丛植株。
定期观察培养情况：包括观察日期、生长情况、以及污染情况等，并做好记录。
（三）康乃馨的继代培养
1、无菌操作准备
将培养基及各种接种用具放入超净工作台，开紫外灯照射消毒20-30min,开送风开关，关紫外灯，通风10min后，打开照明日光灯。
洗手、换鞋、换实验服，戴口罩，进入接种室，开启超净工作台，用纱布吸取75%酒精擦手，擦拭超净台，擦拭培养基和无菌水瓶，点燃酒精灯。
镊子、解剖刀、剪刀等接种工具放入灭菌锅灭菌，待冷却后使用。
2、无菌操作接种
酒精灯火焰旁打开康乃馨芽苗培养基，用镊子取出康乃馨芽苗，置于无菌接种盘内，用解剖刀将芽苗簇切割成含2~3芽苗 然后切去芽苗的上端。
3、培养
用灭菌过的镊子将切好的外植体接种到配置好的接种培养基上，每瓶接2-3
块，每人至少三瓶，可以更多一些。
将培养瓶表面用酒精擦拭消毒 置于培养室进行光照培养。
整理、清洁超净工作台。
4、观察记录
定期观察培养情况：包括观察日期、生长情况、以及污染情况等，并做好记录。
（四）康乃馨芽苗的诱导生根
1、无菌操作准备
将培养基及各种接种用具放入超净工作台，开紫外灯照射消毒20-30min,开送风开关，关紫外灯，通风10min后，打开照明日光灯。
洗手、换鞋、换实验服，戴口罩，进入接种室，开启超净工作台，用纱布吸取75%酒精擦手，擦拭超净台，擦拭培养基和无菌水瓶，点燃酒精灯。
镊子、解剖刀、剪刀等接种工具放入灭菌锅灭菌，待冷却后使用。
2、无菌操作接种
酒精灯火焰旁打开康乃馨培养瓶，用镊子取出康乃馨芽苗置于无菌接种盘， 用解剖刀将芽苗的每个小芽分开。
用镊子将单个小芽插入生根培养基，每瓶接3个。
盖上瓶盖，贴上标签，注明材料名称、接种日期和姓名。
3、培养
将培养瓶表面用酒精擦拭消毒 置于培养室进行黑暗培养。
整理、清洁超净工作台。
4、观察记录
定期观察培养情况：包括观察日期、生长情况、以及污染情况等，并做好记录。
（五）缓苗移栽
试管苗在移栽前几天一般都需要进行炼苗，让它有个逐步适应环境的过渡阶段。
一般方法是先将培养瓶从培养室拿到常温下放置，然后将试管苗容器口上包扎的塞子或纸去掉放置几天，此时需注意保持空气湿度，并防止杂菌污染，杂菌容易很快生长而污染试管苗。
在去掉封口时采用培养基上加薄层水的处理效果较好，即可提高湿度又可减少杂菌生长，但若放置时间较长则需换水。
待试管苗逐步适应外界的光照、温度和湿度后再进行移栽，即可提高移栽成活率。
(六)移栽技术
移栽时，首先将试管苗从所培养的瓶中取出，取时要用镊子小心地操作，切勿把根系损坏，然后把根部粘附的琼脂漂洗掉，要求全部除去，而且动作要轻，以减少伤根伤苗。
（原因:琼脂中含有多种营养成份,若不去掉,一旦条件适宜,微生物就会很快滋生,从而影响植株的生长,甚至导致烂根死亡。
）移栽前,先将基质浇透水,并用一个筷子粗的竹签在基质中开一穴,然后再将植株种植下去,最好让根舒展开,并防止弄伤幼苗。
种植时,幼苗深度应适中,不能过深或过浅,覆土后需把苗周围基质压实,也可只将容器摇几下待基质紧实即可,以防损伤试管苗的细弱根系和根毛。
移栽时最好用镊子或细竹筷夹住苗后再种植在小盆内.
移栽后需轻浇薄水,再将苗移入高湿的环境中,保证空间湿度达90%以上。
五、实验结果与分析
1、统计、记录初代培养的诱导率
2、统计并总结初代培养基的配制方法和步骤
3、统计污染率，并分析污染原因
4、记录接种生根率和存活率，总结驯化移栽的方法和步骤。