实验七尼龙固定化木瓜蛋白酶
一.目的和要求
1、学习和理解尼龙固定化木瓜蛋白酶基本原理。

2、熟练掌握尼龙固定化木瓜蛋白酶基本技术。

进一步理解其和水溶性酶比较所独有的优点。

二.实验原理
通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性的载体结合，固定在载体上，在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。

酶的固定化方法有：吸附法（物理吸附、离子吸附）、包埋法、共价键结合法、交联法。

固定化酶的优越性主要表现在：（1）在大多数情况下，可提高酶的稳定性；（2）提高酶的使用效率，降低生产成本；（3）酶不与产品混合，制品易于纯化；（4）利用固定化酶，工业上可以大批量、连续化生产。

本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。

尼龙长链中的酰胺键，经 HCl 水解后，产生游离的-NH基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO缩合，戊二醛的另一个-CHO则与酶中的游离氨基缩合，形成尼龙（载体）—戊二醛（交联剂）—酶，即尼龙固定化木瓜蛋白酶。

三.实验材料、试剂及仪器
3.1 材料
尼龙布(86)或(66)，100目，剪成3×3cm2。

3.2试剂
1(1) 甲醇溶液(含18.6％CaCL2和18.6％水)（每组50mL）：称18.6克CaCL2溶于18.6 mL蒸馏水，冷却后，用甲醇定容至100 mL。

1(2) 3.5mol／L HCl溶液（每组30mL）：取29.2 mL浓HCl，定容至100 mL。

1(3) 0.2 mol／L硼酸缓冲液(pH 8.4) （每组30mL）：称取0.858克Na2B4O7·10H2O 和0.68克H3BO3用蒸馏水溶解，定容至100 mL。

1(4) 5％戊二醛(以0.2mo1／L pH 8.4硼酸缓冲液配制，每组30mL）：取25％戊二醛20mL，用0.2mo1／L pH 8.4硼酸缓冲液定容至100 mL。

2(5) 0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液（每组250mL）: 称取1.28克Na2HPO4·2H2O 和1克NaH2PO4·12H2O用蒸馏水溶解，定容至100 mL。

2(6) 0.5mo1／L NaCl溶液〔用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液配制〕（每组150mL）: 称取2.93NaCl，用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液溶解，定容至100 mL。

3(7) 木瓜蛋白酶溶液(1mg／mL，用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液配制〕（每组15mL）：称取100 mg木瓜蛋白酶粉末，加1 mL激活剂，研磨10min,用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液溶解，定容至100 mL。

3(8) 激活剂〔用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液配制，含半胱氨酸10mmo1／L，EDTA 1mmo1/L〕（每组50mL）：称取0.12克半胱氨酸和0.04克EDTA，用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液溶解，定容至100 mL。

4(9) 1％酪蛋白〔用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液配制〕（每组20mL）。

称取1克酪蛋白，加100 mL0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液，37℃下保温振荡3h，至酪蛋白溶解。

4(10) 20％三氯乙酸(用蒸馏水配制) （每组40mL）：称取20克三氯乙酸，加蒸馏水溶解，定容至100 mL。

3.3仪器
恒温水浴锅, 紫外分光光度计, 冰箱。

四.实验步骤
4.1固定化酶的制备
(1)每组取5块尼龙布洗净，凉干。

用含18.6% CaC12和18.6%水的甲醇溶液在50℃
下保温10秒钟左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘，取出用水冲去污物，用吸水纸吸干。

(2)尼龙布用3.5mo1／L HCl在室温水解45min，用水洗至pH中性。

(3)尼龙布用5％戊二醛在室温下浸泡偶联20min。

(4) 取出尼龙布，用0.1mol／L pH7.2磷酸缓冲液反复洗去多余的戊二醛，吸干，
立即用酶液(1mg／mL)在4℃下固定3.5h(酶液用量每块布为1mL)。

(5) 从酶液中取出尼龙布(保留残余酶液作测定用)，用0.5 mo1／L的NaCl(用
0.1mol／L pH7.2磷酸缓冲液配制)洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。

4.2 酶活力测定
（1）溶液酶活力测定取0.2mL酶液，加入1.8mL激活剂，37℃预热10min，加入37℃预热10min的1%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，加入20%三氯乙酸2mL反应终止酶反应。

对照管先加入20%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。

过滤，清液于280nm波长下测定光吸收值（表11-1）。

在上述条件下，每10min增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U）（以下同）。

表11-1酶活力测定
试剂溶液酶固定化酶残留酶
CK 1 2 CK 1 2 CK 1 2
激活剂（mL） 1.8 1.8 1.8 2.0 2.0 2.0 1.8 1.8 1.8 酶液/固定化
0.2 0.2 0.2 1块1块1块0.2 0.2 0.2 酶（mL或块）
37℃保温5min
37℃ 1%酪蛋
－ 1 1 － 1 1 － 1 1
白（mL）
37℃反应10 min
20% TCA
2 2 2 2 2 2 2 2 2 （mL），摇匀
1%酪蛋白
1 －－ 1 －－ 1 －－
（mL）
过滤
A280nm
（2）残留酶活力测定同溶液酶活力测定。

（3）固定化酶活力测定取一块尼龙布固定化酶，加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。

五.数据处理及计算
活力回收=（固定化酶总活力数/溶液酶总活力数）× 100％
相对活力=[固定化酶总活力数/(溶液酶总活力数—残留酶活力数)]× 100％
六.注意事项
6.1尼龙布的处理是实验成败的关键，既要让其充分的活化，又不能使其破碎。

6.2固定化酶液浓度最好为0.5-1mg／mL，每块尼龙布用量不宜超过1 mL。

6.3酶活性测定的反应时间一定要准确。

6.4过滤操作要规范。

参考文献
赵亚华主编. 生物化学实验技术教程. 广州：华南理工大学出版社, 2000。