从低温乙醇法F I V组份中分离人血白蛋白的研究Ξ刘鹏翰(广西血液中心,柳州545005)摘 要 以低温乙醇法分离血浆蛋白过程中的F I V组份为原料,经D EA E和C M两步离子交换层析法,可制备出高纯度的人血白蛋白,该制品不含多聚体。
关键词 F I V组份;离子交换层析;人血白蛋白 自从Cohn及其同事们报道低温乙醇法分离人血白蛋白的工艺后,血浆蛋白的分离应用取得了飞速发展;目前,低温乙醇法分离血浆蛋白工艺主要有两种:Cohn6+9法及K istler变法,两种工艺均可制备出符合临床要求的人血白蛋白制品,但收率不高,有相当一部分白蛋白被沉淀到F I V组份(低温法中pH5.80、40%乙醇浓度的沉淀部分)而被废弃掉,本文利用K istler工艺中的F I V组份为原料,通过D EA E和C M离子交换层析法进行人血白蛋白的制备研究。
1 材料和方法111 材料11111 F I V组份 为本中心用K istler工艺分离血浆蛋白过程中的废弃组份。
11112 人白蛋白抗血清 上海生物制品研究所提供。
11113 离子交换剂 D EA E2Sephadex FF, C M2Sephadex FF,Sephacryl S2200(phar m a2 cia).11114 其他试剂 符合《中国生物制品原材料试行标准》中的规定或分析纯试剂。
112 设备1)215c m×30c m带转换接头层析柱,1c m×100c m层析柱(上海浮华层析设备厂)。
2)FH8802UV D eteeto r(温州浮华分析仪器厂)。
3)3507记录仪(四川仪表四厂)。
4)HL22型恒流泵(上海沪西仪器厂)。
5)PH S225型酸度计(上海雷磁仪器厂)。
6)DD S211型电导率仪(上海雷磁仪器厂)。
7)D Y W2A型电泳仪(武汉大学科教仪器厂)。
113 方法11311 制备工艺 如图1。
11312 鉴别试验 双向免疫扩散法,琼脂粉浓度1%,室温扩散24h,考马氏亮兰R250染色,照相。
11313 纯度测定 按《中国生物制品规程》进行。
11314 多聚体测定 凝胶过滤层析法,填料Sephacryl S2200,柱1×90c m,流速1m l m in, PBS缓冲液洗脱,紫外监测仪检测、记录仪记录。
2 结果211 D EA E2Sephadex FF层析结果将K istler工艺中的F I V组份溶解,调整pH至512±0105以后,过D EA E2Sephadex FF层析柱,层析图谱见图2,A为穿透峰,主要为IgG等,B为富含白蛋白峰,供下步层析411药 物 生 物 技 术Phar m aceuticalB i o techno l ogy 1997,4(2):114～117Ξ19960520用,C 、D 分别为经1mo l L N aC l 、0.5mo l L 醋酸钠缓冲液洗脱的杂蛋白峰。
F ig 1.Purificati on of hum an album in from the F I V of k istler m ethod.F ig 2.D EA E 2Sephadex FF Ch rom atograph ic p rocess A :0.01mo l L acetate buffer (pH 5.2)filtrated s o lu 2ti onB :0.025M acetate buffer (pH 4.7)eluted album in fracti onC :1mo l L N aC l w ash ing s o luti onD :0.5mo l L acetate buffer clean ing s o luti on212 C M 2Sephadex FF 层析将D EA E 2Sephadex FF 洗脱的B 峰收集,调整pH 515±0105,上C M 2Sephadex FF 层析柱,层析结果见图3,A 峰为白蛋白,B 、C 为经1mo l L N aC l 和0.5mo l L 醋酸钠缓冲液洗脱的杂蛋白峰,收集A 峰样品,透析浓缩,鉴别和纯度测定。
213 鉴别试验结果见图4,制备样品与人白蛋白抗血清产生了明显的沉淀线。
214 纯度测定结果提取的白蛋白纯度>99%。
215 聚合体测定结果如图5,制备的白蛋白样品中不含多聚体,单体与双体的含量为近100%。
3 讨论低温乙醇法是目前国际上使用最多的人血浆蛋白分离方法,分离过程中有相当一部分白蛋白沉淀到F I V 组份中,若不回收,将造成人血浆资源的浪费,因此,我们根据文献报道的全层析法制备人血白蛋白工艺[1],使511刘鹏翰:从低温乙醇法F I V 组份中分离人血白蛋白的研究F ig 3.C M 2Sephadex FF ch rom atograph ic p rocess A :0.025mo l L acetate buffer (pH 5.5)eluted albu 2m in fracti onB :1mo lL N aC l w ash ing s o luti on ;C :0.5mo l L acetate buffer clean ing s o lutionF ig 4.C ro ss i m m un ity pattern s of samp les to hum an album in an ti 2serumB :hum an album in an ti 2serum .a .b .c :th ree l o ts of hum an album in samp les ;d :1mo l L N aC l w ash ing s o lutionF ig 5.T he gel filtrati on pattern of hum an album in samp le用D EA E 和C M 两步离子交换层析法进行了从低温乙醇法F I V 组份中制备人血白蛋白的工作,从试验结果来看,该方法可以从F I V 组份中制备出高纯度的白蛋白。
参考文献1 Sto lz J F ,R ivat C ,Gesch ier C ,etal .Ch rom atog 2raphy purificati on of a h igh purity hum an p las 2m atic album in fo r C lin ical o r bi o l ogical uses .Sw iss B iotech 1990;8:7611 药物生物技术 4卷Seperati on of Hu man A lbu m i n fro m the F I V of the Cold Ethanol M ethodL iu Penghan(Guang X i B lood Center,L iuzhou 545005)A techn ique of purified hum an album in from the F I V of co ld ethano l m ethod w as studied.T he p reci p itate of F I V w as diss o lved and filtrated,then purified by D EA E2Sephadex FF and C M2 Sephadex FF Ch rom atography.T he final p roduct w as in ratter h igh purity.lt con tained no po ly2 m ers.the di m ers and monom ers con ten t w as100%.Key W ords F I V,Ch rom atography,hum an album in・信 息・日本东丽公司用发酵法建立D型丙氨酸的批量生产技术利用微生物发酵法建立D型丙氨酸的生产技术。
他们用发酵法研制非天然型D型氨基酸的工业生产技术并进入实用化,到目前尚居首例。
由于发酵法是用葡萄糖和氨直接生产D型丙氨酸,所以比以往使用的光学拆分法可大幅度降低成本。
972A225我国基因工程人表皮生长因子将进入临床人表皮生长因子(hEGF)是人体内促进表皮细胞生长的蛋白激素,广泛用于治疗各种创伤、溃疡、角膜和皮肤移植,以及胃和十二指肠溃疡。
目前中试工艺的放大试验正在进行中,临床申报工作也在筹备中。
972A226脱氧核糖核酸酶即将得到批准美国过敏药物顾问委员会向美国食品和药物管理局(FDA)推荐批准加洲的Gtech Inc公司推出的CF治疗剂Pul m ozym e。
该公司很可能得到FDA的认可。
要把这种药物推向市场的障碍是规模放大。
972A227 Am gen公司的干细胞因子正在进行人临床试验由美国Am gen公司开发的SCF已被用于对乳腺癌和淋巴癌病人进行临床试验。
研究人员指出,此因子用于晚期乳腺癌病人并配合化疗,除可增加骨髓和全身血中的祖细胞外,还可增加血液循环中性白细胞数目。
SCF是一种集落刺激因子,此因子可促进所有血细胞的产生。
972A228纤维素酶及在酿酒工业中的应用适用于食品发酵工业用的无毒性曲霉株生产纤维素酶,并将其用于酿酒。
通过培养条件试验,确定了最佳产酶培养工艺,使纤维素酶曲滤纸酶活力达到150m g g・h以上的指标,再经工艺试验,将纤维素酶曲在液态法白酒生产中应用,使原料出酒率提高2%以上,缩短发酵周期1 7以上。
达到指标为:酶活力180～200m g g・h,提高酒精生产率6. 25%,相当于提高原料出酒率3124%,缩短发酵周期1 6。
972A229711刘鹏翰:从低温乙醇法F I V组份中分离人血白蛋白的研究。