中华绒螯蟹养殖群体与野生群体的种群遗传学研究作者：周华兴段国庆江河凌俊胡玉婷来源：《农学学报》2022年第06期摘要：研究旨在探究安徽中华绒螯蟹种质资源状况以及资源混杂程度，以期为中华绒螯蟹资源的科学保护、合理利用以及相关产业政策的制定提供理论依据。
采集了中华绒螯蟹4个养殖群体和长江野生群体共170尾样本，基于线粒体分子标记，进行种群遗传学分析。
结果表明，长江野生中华绒螯蟹遗传多样性低，盲目捕捞可能造成野生资源衰退。
野生群体与养殖群体间未出现显著遗传分化，存在严重的种质混杂。
研究探明了长江中华绒螯蟹的资源现状，为其科学的保护提供理论依据。
关键词：中华绒螯蟹；养殖与野生群体；线粒体基因；种群遗传分析；种质混杂中图分类号：S917.4文献标志码：A论文编号：cjas2020-0158Population Genetics of Chinese Mitten Crab Between the Breeding and Wild PopulationsZHOU Huaxing， DUAN Guoqing， JIANG He， LING Jun， HU Yuting（Fisheries Research Institution， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Anhui Key Laboratory of Aquaculture and Stock Enhancement， Hefei 230031， Anhui， China）Abstract： Eriocheir sinensis， especially the Yangtze mitten crab， is an important aquaculture species in China. In recent years， serious germplasm mixture of this species has been detected and little is known about the reasons. In this study， population genetics among wild and breeding populations of the Chinese mitten crab was comparatively analyzed based on mitochondrial marker in order to explore the germplasm mixed level. The results show that the genetic diversity of wild crab in the Yangtze River is low， and over fishing could cause the decline of wild resources. No genetic difference among the wild and breeding populations is detected， which means serious germplasm mixture. This study clarifies the resource status of Chinese mitten crab in the Yangtze River， and can provide a scientific basis for the protection of this species.Keywords： Chinese mitten crab； the breeding and wild populations； mitochondrial gene；population genetics analysis； germplasm mixture0引言中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis），俗称河蟹，隶属节肢动物门、甲壳纲、十足目、方蟹科、绒螯蟹属，是重要水产养殖品种，其营养价值丰富，口味鲜美，深受人们喜爱。
20世纪70年代末，中华绒螯蟹内陆水域人工育苗技术难关攻克，增养殖业有了长足的发展[1]。
尤其是在20世纪90年代，养殖产业突飞猛进，极大的推进了中华绒螯蟹资源的开发与利用。
中华绒螯蟹是典型的降海洄游型生物，其幼体在江、河等淡水中生长发育至成熟个体后，顺水而下至入海口等咸水中繁殖[2]。
长江入海口浅滩广阔、资源丰富，是中华绒螯蟹天然的繁育场[3]。
野生中华绒螯蟹在长江口繁殖后，逆流而上，在长江流域生长发育，形成特有的長江品系，沿江流域也随之开展了大量的河蟹养殖。
然而，养殖过程中大规模跨地域的引种以及养殖群体的逃逸都可能造成中华绒螯蟹野生群体的种质混杂[4-5]。
王海华[6]采用线粒体控制区序列对长江水系7个野生群体的遗传多样性分析结果表明，长江水系中华绒螯蟹各个群体间分化不显著，没有出现与地理分布相对应的谱系结构。
李晶晶等[7]利用10个微卫星分子标记分析了中华绒螯蟹3个不同水系人工选育群体和1个野生群体的遗传分化水平，结果表明4个群体的遗传分化程度处于中低水平。
学者认为遗传漂变的缺失和显著的同质化是造成种质混杂的内在因素[8]。
为探究中华绒螯蟹养殖群体对野生群体的遗传多样性影响，本研究采集长江流域安徽段野生群体样本以及邻近的养殖群体样本，结合相关分子学手段，探究长江中华绒螯蟹种质资源状况以及资源混杂程度，以期为中华绒螯蟹资源的科学保护、合理利用以及相关产业政策的制定提供理论依据。
1材料与方法1.1样本采集研究于2016年采集了江流域安徽段中华绒螯蟹4个主要养殖区，分别是芜湖县、无为县、当涂县、宣州区（如图1、表1所示）的养殖样本共计140尾；采集长江流域芜湖至马鞍山段中华绒螯蟹野生样本30尾。
样本采集后，取其腿部肌肉保存于-20℃下。
实验于2016年12月—2018年3月，在水产增养殖安徽省重点实验室进行。
1.2基因组DNA提取与PCR扩增取中华绒螯蟹肌肉组织，采用Sambrook法提取基因组DNA[9]。
参照NCBI上已有的中华绒螯蟹线粒体DNA（mtDNA）全序列数据（登录号：KP126617），使用Oligo7[10]设计线粒体COII基因的引物（表2），并委托上海生工生物有限公司合成。
PCR反应体系：包含200 ng的模板DNA，10×Buffer缓冲液（TaKaRa）5μL，dNTP（2.5 mM）3μL，MgCl2（2.5 mol/L）4μL，上下游引物（5μmol/L）各2μL，TaqDNA聚合酶0.75 U，补充无菌超纯水至50μL。
PCR反应条件：96℃预变性1 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共34个循环；最后72℃延伸10 min。
PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，预期长度的线粒体DNA片段通过DNA纯化试剂盒（DNA Gel Extract Purification Kit， TaKaRa）回收后，委托上海生工生物有限公司双向测序。
1.3序列分析测序所得序列通过Seqman软件辅助人工进行拼接组装。
序列通过MAFFT v.7[11]在线比对后，使用DNAsp v.6.11[12]计算多态位点、单倍型数目、单倍型多样性（Haplotype diversity， Hd）和核苷酸多样性（Nucleotide diversity， Pi）。
使用Arlequin v.3.11进行分子变异分析（Analysis of Molecular Variance， AMOVA）[13]。
使用Mega v.7.0[14]基于邻接法（Neighbour joining， NJ）构建单倍型分子系统树。
采用Network 5000基于中介网络法（Median Joining， MJ）绘制單倍型网络关系图[15]。
2结果与分析2.1序列特征测序获得170条长度为799 bp的中华绒螯蟹线粒体COII基因序列，共检测到突变位点38个，其中简约信息位点10个，单突变位点28个。
基因片段中，T、C、A、G四个碱基的平均含量分别为35%、19.4%、31.2%、14.4%。
A+T的含量为66.2%，大于G+C的含量33.8%。
基因序列出现了明显的反G偏倚（Anti-G bias）现象[16]。
2.2单倍型进化分析中华绒螯5个群体中共检测出12种单倍型，其中XZ群体有7种单倍型，WH群体有6种单倍型，DT和WW群体均有5种单倍型，YS群体有4种单倍型（见表3）。
12种单倍型中，Hap 6、11、12为群体特有单倍型，其余9个单倍型均为群体共享单倍型。
选择日本绒螯蟹COII序列（登录号：NC_011597）作为外类群，构建单倍型系统发育树，结果表明，Hap 12独立成支，其余11个单倍型聚为一支。
单倍型网络关系分析结果表明，Hap 1和2包含了所有的群体，且Hap 2的共享个体数最多，为98个。
除Hap 12外（突变步数为30），其余11个单倍型间的突变步数均为1（图2）。
2.3遗传多样性和分子变异分析种群遗传多样性分析结果表明DT群体单倍型多样性最高，XZ群体核苷酸多样性最高；WW群体的单倍型多样性和核苷酸多样性均最低，分别为0.4090和0.0006。
野生中华绒螯蟹YS群体的单倍型多样性为 0.5450，核苷酸多样性为0.0008，仅高于WW群体。
分子变异分析结果表明，群体内的分子变异为96.54%，远高于群体间的变异（3.46%， P 3讨论3.1长江野生中华绒螯蟹遗传多样性遗传多样性是生物群体抗逆和进化的潜在动力，也是种群适应外界环境能力最直观的反映[18]。
群体的遗传多样性水平往往受到多种因素的影响，如谱系分选、特殊的生活史等[19-20]。
中华绒螯蟹作为重要的水产品，具有极高的经济价值，其自然群体受到人类活动的影响较大。
中华绒螯蟹线粒体COII基因序列中，A+T的含量为66.2%，G+C的含量为33.8%，表现出明显的碱基组成偏倚。
有学者基于线粒体COI基因序列的中华绒螯蟹野生群体遗传多样性分析[21]中，A+T的含量为61.7%，G+C的含量为38.3%，这与本研究的结果相印证。
本研究中，长江芜湖-马鞍山江段的野生中华绒螯蟹遗传多样性水平较低（Hd=0.5450；Pi=0.0008），低于2008年报道的长江南京江段中华绒螯蟹群体遗传多样性（Hd=0.8433；Pi=0.0048）[22]和2016年报道的长江口中华绒螯蟹群体遗传多样性（Hd=0.8333； Pi=0.0077）[21]。
这说明长江流域中华绒螯蟹群体近年来出现了种质退化现象。