关键词： 宏基因组研究； 不可培养微生物； 生态学； 新基因资源 中图分类号： Ｘ１７２ 文献标识码： Ａ 文章编号： １００３－ ６５０４（２００７）１２－ ０１００－ ０４
传统培养方法筛选和开发天然活性物质， 通常包 括微生物分离、大量培养、培养物收获、目标物质抽提、 目标物质鉴定、目标物质开发利用等步骤。研究发现利 用传统微生物培养方法不能真实地揭示微生物多样性。 一般环境中可培养的微生物仅为少数， 而９８％￣９９．８％ 的 微 生 物 无 法 采 用 传 统 的 方 法 进 行 分 离 培 养［１］。而 实 际 上未培养（ ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ） 或非培养（ ｎｏｎ－ ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ） 的微 生物才是环境微生物的 主 体［２］， 众 多 的 生 物 学 家 和 化 学家都认为它是一个具有巨大潜力的种群。
ＤＮＡ 片 段 的 大 小 一 直 是 文 库 构 建 的 关 键 问 题 。 通常， 小片段 ＤＮＡ（ ＜１０ｂｐ） 插 入 到 质 粒 或 λ载 体 中 ， 在宿主 Ｅ．ｃｏｌｉ 中克隆表达； 大片段 ＤＮＡ 插入到柯斯质 粒（ ｃｏｓｍｉｄ） 或细菌人工染色体（ ＢＡＣ） 中， 也在宿主 Ｅ． ｃｏｌｉ 中克隆表达［１５］。近来研究表明， Ｂａｃｉｌｌｕｓ 或 Ｓｔｒｅｐ－ ｔｏｍｋｙｃｅｓ 作为宿主菌体， 也可取得较好的表达效果［１５］。 ２．３ 目的基因的筛选
第 ３０ 卷 第 １２ 期 ２００７ 年 １２ 月
宏基因组研究及其应用研究进展
艾芳芳， 杨桦， 曲媛媛 ＊， 周集体， 李昂， 关晓ห้องสมุดไป่ตู้， 苟敏
（ 大连理工大学环境与生命学院， 大连 １１６０２４）
摘 要： 传统的微生物培养方法损失了近乎 ９９％的微生物资源， 而宏基因组研究能够直接从环境中提取全部微表达蛋白， 该研究能够最大限度地开发微生物的序列空间。文章简要概 述 了 宏 基 因 组 研 究 的 产 生 、原 理 及 其 在 生 态 学 方 面 的 发 展 和 对 新 基 因 资 源 的 开 发 和 利 用 。
对于功能分析而言， 首先需要获得目的克隆， 然后 通过序列和生化分析对其进行表征。这种方法能够快 速鉴定出全新且有开发潜力的活性物质， 可用于医药、 农业或工业等行业。由于该方法的检出率较低， 工作量 较大， 并且受到检测手段的限制， 所以常常要借助于高 通量筛选（ ＨＴＳ） ［２０］。有些研究者提出了新的方法来提高 检出率， 如将载体改进成“梭形载体”（ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒ） ［１１］。
中率。Ｄｏｎ Ｃｏｗａｎ提取 ＤＮＡ 片段、操纵子的克隆是行之有效的［７－１０］， 同时， 证明 辅助培养的方法对目的微生物多样性的影响不大［１１］。
ＤＮＡ 的 提 取 是 宏 基 因 组 文 库 构 建 的 关 键 步 骤 。 提取步骤通常需要满足两个条件： 既要尽可能的提取 样品基因组， 又要保持片断的完整和纯度［６］。目前， 所 研发的 ＤＮＡ 提取方法有两种： 细胞提取法和直接裂 解法。直接裂解法还包括物理法， 如冻融法、超声法、 玻璃珠击打法、液氮碾磨法等； 化学法， 常用化学试剂 有表面活性剂、盐类、有机溶剂等； 酶法。不同提取方 法的差别在于细胞破壁的方式和宏基因组快照测序方法相 结合也可以将微生物与其在环境中的代谢过程相联 系。Ｓｃｈｍｅｉｓｓｅｒ Ｃ 等在对饮用水系统进行研究时， 对 ６５０ 个 １６Ｓ ｒＤＮＡ 克隆进行分析， 结果表明有 ８１ 种不 同种类的克隆， 其中 ８６％属于变形细菌。基因组快照 测序探测到 １０２６ 种克隆假拟蛋白的基因， 其中一些 与现今已知的微生物蛋白十分相似［２４］。
宏基因组研究是新药物开发的手段之一。其中一 个方面是对共生菌的研究， 共生菌是自然界中重要的 药物， 也是纯培养难以获得的。为了在宏基因组中获 得特殊功能和罕见 Ｉ 型聚酮化合酶， ＰＣＲ 技术已在甲 虫和海绵微生物共生体中分别发现了 ３ 和 ６０ 个罕见 Ｉ 型聚酮化合酶的阳性克隆， 而且发现其在单一宿主 中是可生存的。这意味着对聚酮化合酶的了解越来越 深入， 并且可能合成新型抗肿瘤药物［２９］。
３ 宏基因组研究在生态学方面的研究进展 基 于 １６Ｓ ｒＤＮＡ 的 研 究 方 法 大 大 促 进 了 微 生 物
生态学的发展。通过对环境样品 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因片段 进行 ＰＣＲ 扩增， 并结合克隆和测序已获得大量的微 生物信息。此方法可用于对微生物进行分类。２０ 世纪 ６０ 年代， Ｗｏｅｓｅ 在测定了原核生物 １６Ｓ ｒＲＮＡ 和真核 生物的 １８Ｓ ｒＲＮＡ 的寡聚核苷酸顺序谱的基础上， 从 序列差异计算出它们之间的进化距离， 绘制出系统发 育树（ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ） 。Ｗｏｅｓｅ 的系统发育
４ 宏基因组研究有助于新基因资源的开发和利用
４．１ 新药物的发现 自从 Ｆｌｅｍｉｎｇ 发现微生物产生青霉素以来， 微生
物就成为抗生素和其他途径的有效方法。将 Ｉ 型聚酮化合酶引入 Ｅ．ｃｏｌｉ 和 Ｓ．ｌ 个阳性克隆。序列分 析发现这些克隆中包含与已知 Ｉ 型聚酮化合酶的相似 度很高的新 Ｉ 型聚酮化合酶。Ｉ 型聚酮化合酶由三个 酮肟结构域组成， 对酮肟结构域 Ｋｅｔｏｓｙｎｔｈａｓｅ（ ＫＳ） 的 研究表明， 酮肟结构域可能决定微生物的来源， 酮肟 结构域的变化将直接影响生物合成的产物。将克隆的 酮肟结构域与由 ２３ 个已知酮肟结构域的系统发生树 比较， 有可能发现包含新 Ｉ 型聚酮化合物生物合成途 径的克隆。
２ 宏基因组研究的原理
宏基因组研究分为 ３ １ 所示。 ２．１ 宏基因组的提取
在宏基因组筛选过程中， 目的基因是整个核苷酸 中的一小部分， 因此样品前期的富集能够提高筛选命
基金项目： 国家自然科学基金资助项目（ ５０６０８０１１） 作者简介： 艾芳芳（ １９８２－ ） ， 女， 硕士研究生， 主要从 事 环 境 污 染 治 理 技 术 的 开 发 与 研 究 ，（ 电 话） ０４１１－ ８１１８９０６０ （ 电 子 信 箱） ｑｙｙ００７＠１２６． ｃｏｍ； ＊ 通讯作者： 讲师， 硕士生导师，（ 电子信箱） ｑｙｙ００７＠１２６．ｃｏｍ。
宏基因组已经成为当今研究的热点， 其研究目的 主要有两个方面： 第一， 期望了解更多微生物体系的 功能， 宏基因组研究是研究非培养微生物体系功能和 生物多样性之间联系的唯一手段； 第二， 宏基因组的 研 究 有 助 于 新 药 物 、新 型 生 物 催 化 剂 和 其 他 有 价 值 的 活性物质的开发和利用， 如图 ２ 所示。以下针对宏基 因组研究在生态学方面的发展及对新基因资源的开 发和利用作以介绍。
目的基因的筛选方法包括序列分析和功能分析
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宏基因组研究及其应用研究进展 艾芳芳， 等
两种。序列分析适用于小片段 ＤＮＡ 的基因筛选； 而功能分析通常用于大片段 于重组基因在外源宿主中的表 达。因为所使用的寡聚核苷酸引物是直接通过 ＤＮＡ 序列中的保守区域设计的， 反映了氨基酸序列的保守 性， 可获得未知序列的目的基因。迄今， 研究者运用序 列 分 析 筛 选 已 经 发 现 了 几 种 新 的 酶 ， 木 聚 糖 酶［１７］、聚 酮 化 合 酶［１８］和 几 种 与 生 物 工 业 相 关 的 酶［１９］。 一 般 情 况 下， 空间序列是自然存在的， 因此采用正确的方法可 以进行序列分析。该方法对 ＤＮＡ 量的要求不高［１５］， 筛 选到新活性物质的可能性较大。序列分析的另一个手 段是对宏基因组克隆测序， 无论是全部或随机测序都 是发现新基因的有效手段［２０］。
１ 宏基因组研究的诞生
研究者为了获得完整的基因表达产物， 提出了直 接 从 环 境 样 品 中 提 取 生 物 ＤＮＡ 的 研 究 思 路 ， 早 在 １９７８ 年， Ｔｏｒｓｖｉｋ 等［３］提出宏基因组研究。１９９１ 年， Ｐａｃｅ 等［４］将这种方法称为 Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｅｓ。直到 １９９８ 年 ， ＡＲＩＡＤ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ 公 司 的 科 学 家 Ｈａｎｄｅｌｓ－ ｍａｎ 等［５］才首次提出宏基因组（ Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ） 的概念。 宏基因组是特定环境全部生物遗传物质的总和， 起初 是用来定义土壤细菌总 ＤＮＡ， 揭示土壤细菌宏基因 组 的 特 点 并 从 中 发 现 新 药 物 的 。 而 基 因 组 文 库（ ｌｉ－ ｂｒａｒｙ） 是指在规定的概率水平上包含特定 ＤＮＡ 片段 的重组子集合， 每一个重组子携带一个 ＤＮＡ 片段。
当今微生物生态学研究的主要目的之一是将微 生 物 与 其 所 在 环 境 中 的 代 谢 过 程 相 联 系 。 应 用 １６Ｓ ｒＤＮＡ 作 为 系 统 发 生 锚 去 鉴 定 属 于 某 种 微 生 物 的 克 隆， 然后对基因进行测序， 从而获得微生物的生理学 信息。在研究早期， 科学家利用宏基因组研究探索海 洋中非培养的以浮游生物为环境样品 ＤＮＡ 测序均发现了古菌螺旋状 ＲＮＡ 和 谷氨酸半醛转氨酶， 并且首次揭示了基因组织形态， 这些信息都显示了非培养系统的生物潜能［２２］。借助同 样的方法， Ｂéｊà等人发现了 γ变形细菌视紫质克隆的 开放阅读框， γ变形细菌是海洋表面水域中分布最广 泛的细菌之一， 并首次指出 γ变形细菌具有一种新的 光养作用途径。该变形视紫质基因广泛存在于海洋微 生物中， 由此可推测该光养作用是一种全球性的海洋 微 生 物 途 径［２３］。
随着微生物治理的深入发展， 研究者们越来越趋
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向于应用菌群对废水进行生物治理。而宏基因组研究 为 菌 群 的 组 成 、动 态 变 化 以 及 主 要 功 能 群 种 的 确 定 提 供了手段与方法［２６－ ２７］。宏基因组在生态学方面的研究 还有许多问题有待解决， 例如， 如何鉴定携带特定基 因的克隆。一种经典的直接满足宏基因研究需求的微 生物生态学技术是荧光原位杂交技术（ ＦＩＳＨ） ［２８］。
树， 将地 球 上 所 有 细 胞 生 命 分 为 三 个 域（ ｄｏｍａｉｎ） ： 细 菌（ ｂａｃｔｅｒｉａ） 、古 菌（ ａｒｃｈａｅａ） 和 真 核 生 物（ ｅｕｋａｒｙａ） ［２１］。 应用传统的培养技术对土壤进行分析， 发现它的生物 多样性较低， 但是运用 １６Ｓ ｒＤＮＡ 方法分析发现土壤 是地球上生物多样性最丰富的资源之一。可见传统的 培养技术在一定程度上限制了生物多样性的开发， 而 宏基因组研究却显示出了强大的功能， 有着广阔的应 用前景。