DNA或cDNA 载体：质粒载体（ plasmid ）、黏粒载体（ cosmid ）、人工染色体 （BAC、YAC）等 宿主：大肠杆菌（E.coli）、酵母（Saccharomyces ce经纯化后部 分酶切，然后把这些 DNA 片段连接到载体 上，胞获得的新功能进行筛选 , 或用 相关已知序列设计探针或 PCR 引物寻找并 分离目的基因片段，加上表达调控元件后使 目的基因表达，从而获得产物。
E.coli 4639221bp p=99% f=20kb/4600kb n=1056.9
p=99% f=10kb/4的外源
DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的
特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA
经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组


1976年L.Clark,p)/大小与基因组DNA大小的比值
哺乳动物 3×109kb 若p=99% 平均克隆片段20kb f=20kb/3×109 n=690773.2
常见筛选工具: 探针
狭义: 核酸, 抗体 广义: 还包括其他筛选手段
一、功能筛选
利用目标基因的特定功能进行筛选 • 抗性基因: antibiotics抗性基因, 抗重金属活 性 • 分解基因: 苯环化合物, 分解酶 • 功能活性：杀虫，酶 • 启动子/复制子
Vector
Amp ori
MCS
Tet gene without promoter
以此突变体作为宿主
在野生型的DNA导入后检测回复突变
如 营养缺陷型 相关的基因
二、核酸探针 • 同源DNA探针
高度保守的基因 rRNA基因
邻近种属的相应基因
相应基因的序列比较
• 合成寡核苷酸
蛋白质N-末端aa序列 简并探针degeneracy 选取简并程度低的aa序列
° 根据密码子的使用频率, 合成猜测体探针 ° 设计两组简并探针, 用第二个探针对第一次筛 选的阳性acteria in pure culture is typically the first step in investigating bacterial processes.

standard culturing techniques account for 1% or less of the bacterial diversity in most environmental samples
sequencing of ribosomal RNAs and the genes encoding them was introduced to desnment.

The most startling result of the many microbial diversity studies that have employed 16S RNA culture-independent methods is the richness of the uncultured microbial world.
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在Tet 平板上筛选抗性菌落, 可得到promoter
其他标记: gfp, Kan
质粒复制单位的克隆 Amp ori
MCS
目标宿主可用的 抗性gene
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在抗性平板上筛选抗性菌落, 可得到质粒复制单位
• 功能缺失
在获得相应突变体的前提下

a suite of culture-independent techniques are needed to complement efforts to culture the thousands or millions of unknown speci能的话 设计一对, 用PCR产物作探针
三、免疫
在可获得PT后, 制备抗体, 用于筛选
四、高表达基因
高丰度mRNA, 如 用苯肼作了贫血处理的兔网织 红细胞中,血红蛋白mRNA的含量占绝大多数
五(1)、差别杂交 五(2)、扣除杂交
六、mRNA差别显示
Differential display PCR, DD PCR
如无特殊需要(如单个λ phage不能包容靶基因片段 或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克 多
YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段
BAC 可减少DNA分子间的重组
DNA
Plasmid λ Phage Cosmid BAC YAC
<10kb 0-23kb ~45kb ~ 100kb ~ 300kb-1.2Mb
粘粒克隆所需的克隆子数是λ phage的一半， 如λ 需700000时，cosmid需350000个
七、酵母双杂交系统
用于分离与某一已知蛋白发生相互作子，该蛋白结合 在gal基因上游激活区(UAS)可启动gal基因的转录
GAL4蛋白：可分为两个区域 DNA-BD: DNA结合域, N-末端 1-147aa AD: 转录激活域， C-末端 768-881aa