基因探针技术及其在食品卫生检测中的应用徐茂军(杭州商学院食品生物与环境工程学院,杭州,310035)摘　要　建立在DNA 杂交基础上的基因探针技术是现代分子生物学中的一种常规技术。

用基因探针技术检测食品中的有害微生物具有特异性强、灵敏度高和操作简便、省时等优点。

近年来,有关非放射性基因探针、DN A 生物传感器探针及分子信标探针等技术研究取得的重要进展,必将加速基因探针技术在食品微生物检测中的应用。

本文对多种基因探针的技术原理与研究应用概况及最新进展进行了综述讨论。

关键词　基因探针　食品病原菌　检测作者:硕士,副教授。

收稿时间:2000-08-03,改回时间:2000-10-19 食品卫生检验中的一个十分重要的内容是及时准确地检测出食品中的病原性微生物。

这些病原性微生物的存在会给消费者的健康带来极大的危害。

传统的微生物检测方法一般都涉及到对病原性微生物的培养、形态及生理生化特性的分析等程序[1],经长期的实践证明,这些传统方法是比较有效的,而且检测病原性微生物的特异性也比较高。

但传统的微生物检测方法亦存在不少问题,例如检测成本高、速度慢、效率低,而且有些病原体生长速度很慢,很难用传统方法检测。

由于传统的微生物检测方法需要对病原菌进行人工培养,因而比较适宜于对那些已知的微生物进行检测,而对一些新的病原菌用传统方法进行检测就具有一定的盲目性。

另外还有些病原体,如某些类菌原体(mi -croplasm ),甚至无法通过人工培养方法获得[2]。

基因探针技术作为现代分子生物学中的一种技术手段,应用于食品微生物检测不但能克服传统食品微生物检验方法的不足,而且还具有特异性强、灵敏度高和操作简便、省时等优点[3]。

1　基因探针技术原理基因探针或DNA 探针技术检测微生物的依据是核酸杂交,其工作原理是2条碱基互补的DNA 链在适当条件下可以按碱基配对原则,形成杂交DNA 分子。

已知每个生物体的各种性质和特征都是由其所含的遗传基因所决定的,例如一种微生物的病原性就是由于这种微生物含有并表达了某个或某些有害的基因而产生的。

从理论上讲,任何一个决定生物体特定生物学特性的DNA 序列都应该是独特的。

如果将某一种微生物的特征基因DNA 双链中的一条进行标记,例如用32P 同位素标记,即可制成DNA 探针。

由于DNA 分子杂交时严格遵守碱基配对的原则,通过考查待测样品与标记性DNA 探针能否形成杂交分子,即可判断样品中是否含有此种微生物,并且还可以通过测定放射性强度考查样品中微生物数量。

2　DNA 探针技术研究进展自1975年Southern 首次提出DNA 探针杂交技术以来,DNA 探针技术在许多方面都已获得了改进和发展,并已成为现代分子生物学中一种基本技术。

目前所使用的DNA 探针杂交方法总体上可以分为2类:一是异相杂交(heterogeneous assay )即固相杂交技术;二是同相杂交(homogeneous assay )即液相杂交技术。

另外根据DNA 探针的标记方法可分为放射性标记探针和非放射性标记探针。

2.1　异相杂交技术2.1.1　Southern 印迹法Southern 印迹法(Southern blotting )是最早的DNA 探针杂交技术,由英国分子生物学家Southern 所发明。

Southern 印迹法的全过程见图1。

首先将从待检测样品中提取的DNA 经限制性内切酶降解后,用琼脂糖凝胶电泳进行分离。

将带有DNA 片段的琼脂糖凝胶浸泡在碱中使DNA 变性,然后将变性的DNA 转移到硝酸纤维素膜上,在80℃下烘烤4～6h ,使DNA 牢固地吸附在膜上,然后与放射性标记的DNA 探针进行杂交数小时后,通过洗涤除去未杂交的DNA 探针。

将硝酸纤维素膜烘干后进行放射自显影,杂交结果即可在X 光片上显示出来[4]。

图1　Southern 印迹法原理示意图2.1.2　非放射性DNA 探针最早使用的DNA 探针都是用同位素标记的。

目前,放射性标记探针仍然是许多实验中常用的DNA 探针,其中使用最多的是放射性标记元素32P 。

用来标记的同位素的放射性强度越高,信噪比也就越高,结果越好。

但是32P 有一些其自身难以克服的缺点,一是寿命短,其半衰期只有13d ;二是操作起来比较危险;三是要求有特殊的实验操作设备;四是放射性废弃物的处理十分繁琐。

为此人们研究开发了非放射性DNA 探针检测方法。

目前比较常见的非放射性DNA 探针检测系统是通过酶促反应将特定的底物转变为生色物质或化学发光物质而达到放大信号的目的。

具体操作时大多采用将生物素(bi -o tin )标记的核苷酸掺入到DNA 的方法制备图2　非放射性DNA 探针检测原理示意图探针。

操作过程(见图2)大致如下:(1)将生物素标记的探针杂交到目标DNA 上去;(2)加入抗生物素蛋白(avidin )或链霉抗生物素蛋白(streptavidin );(3)加入一种经生物素标记的酶,如过氧化物酶或碱性磷酸酶;(4)根据不同的酶,加入不同的生色或化学发光的底物,根据颜色变化或化学发光来检测杂交结果[2]。

2.1.3　DNA 生物传感器探针DNA 生物传感器探针技术是近年来发展起来的一项新技术。

目前研究使用的大部分DNA 生物传感器探针的技术原理是将DNA 探针固定在支持体的表面,通过检测DNA 探针与特定的目标DNA 的专一性杂交而产生的光、电等信号的变化考查DNA 探针的杂交情况。

与一般的异相杂交技术相比,DNA 生物传感器探针技术中省去了对DNA 探针进行放射性同位素标记或酶标记的处理。

而且很多DNA 生物传感器装置可以实现对DNA探针杂交过程的实时监测。

目前,人们已用石英晶体微天平、表面等离子体子共振等技术构造DNA 生物传感器[5],获得了较好的结果。

下面以金钦汉等最近报道的γ-干扰素表面等离子体子共振(surface plasmon res -onance ,SPR )DNA 生物传感器为例说明其工作原理及大致过程[5]。

该装置以碘钨灯作光源,同时检测400～800nm 波长范围内反射光强度与入射波长的关系。

利用生物素-亲和素系统的相互作用将DNA 探针固定于金膜表面(见图3),通过测定杂交过程中体系的共振波长的变化值,考查DNA 探针的杂交情况。

图3　利用生物素-亲和素系统固定DNA 探针的原理示意图2.2　同相杂交2.2.1　双探针常规技术固相杂交中,探针非特异结合于支持物表面,降低了灵敏度。

同相杂交技术最早由Heller 和Mirriso n 提出,该项技术的特点是不需要支持物,减少了固定DNA 以及去除未杂交DNA 等操作。

常规的同相杂交技术中使用了2个探针,这2个探针分别与目标DNA 的2个相邻区域互补。

第1个探针在3′末端标记,第2个探针在5′末端标记,利用标记物的光谱特性,使第一标记物为第二标记物的能量供体。

当探针与目标DNA 杂交时,2个探针彼此靠近,通过光吸收或化学反应激发供体标记物,并通过能量转移引起受体标记物的激发,因此通过测定第一标记物发射光的减少或第二标记物发射光的增加即可定量考查DNA 探针的杂交情况[6]。

另外一种双探针同相杂交技术所采用的2个探针的碱基互补,且与目标DNA 上的同一序列相对应。

将一个探针的5′末端标记荧光素,另一互补探针的3′未端标记荧光素淬灭剂。

当无目标DNA 时,两探针结合,荧光素的能量转移至淬灭剂,不产生荧光。

存在目标DNA 时,探针与目标DNA 之间竞争杂交,并在494～496nm 光照下产生荧光。

荧光信号的强度与目标DNA 的浓度成正比[6]。

2.2.2　分子信标探针同相杂交一般同时采用2个标记探针,最近Tyag i等首次建立了分子信标探针(molecular beacon probe),即在同一探针的5′末端标记荧光素,3′末端标记荧光素淬灭剂。

分子信标探针的工作原理如下:当无目标DNA时,DNA探针由于两端碱基的互补配对而形成发夹结构,使荧光素靠近淬灭剂,荧光素接受的能量通过共振转移至淬灭剂,淬灭剂吸收能量后以热量形式散失,结果不产生荧光。

当有目标DNA存在时,由于分子信标探针的噜扑环与目标DNA的碱基互补,因此通过与目标DNA的分子杂交,形成了比发夹结构更加稳定的杂交双链DNA分子,探针的构型同时发生改变,使两臂分开,荧光素和淬灭剂也随之分开,此时在紫外光下,荧光素产生荧光。

Sanjay用与噜扑环完全互补且等长的DNA与分子信标探针杂交,发现当目标DNA中有一个碱基错配或缺失时,均不产生荧光,因此认为只有完全互补的DNA才能与分子信标探针杂交,可见分子信标探针具有高度特异性。

2.3　PCR与DNA探针检测技术通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PC R)技术可以特异性扩增出致病菌的某一特定的DNA序列,因此PCR技术常与DNA探针技术联合使用,用于检测样品中微量的病原微生物,这大大提高了DNA 探针检测技术的灵敏度[3]。

由于利用PCR 进行DNA序列扩增时,对模板的要求量很少,因此即使样品中致病菌的数量很小,亦无需进行病菌的分离培养[3]。

PCR与DNA探针结合使用检测样品中致病微生物的一般程序是,首先对待检样品中的目标DNA进行PCR特异性扩增,然后用上述的各种DNA探针检测PCR扩增产物[3]。

利用PCR技术虽然可以显著提高DNA 探针的检测灵敏度,但由于PCR的极度灵敏性,常出现因操作污染而产生假阳性,目前已有一些方法可以防止假阳性的产生,比较简单的方法是将模板的扩增与探针检测放在同一个封闭的试管中进行。

3　DNA探针技术在食品微生物检测中的应用 近年来DNA探针杂交技术在食品微生物检测中的应用研究十分活跃,目前已可以用DNA探针检测食品中的大肠杆菌(Es-cherichia coli)[7]、沙门氏菌(Salmonella)[8]、志贺氏菌(Shigella spp)[9]、耶希氏菌(Yersinia enterocolitica)[10]、李斯特菌(Lis-teria monocytogenes)[11]、金黄色葡萄球菌(S taphylococcus aureus)[12]等。

Wang等对用DNA探针杂交技术检测食品中13种常见的致病菌的一般方法进行了概述[13]。

用DNA探针杂交技术检测食品中微生物的关键是DNA探针的构建。

为了保证检测方法的高度特异性,必须根据具体的检测目标,构造各种不同的DNA探针。

构建检测食品微生物DNA探针的原则是以待检微生物中的特异性保守基因序列为目标DNA,以该序列的互补DNA作为杂交探针。

对一般微生物而言,可以用决定该微生物特有的生理、生化特性的基因序列构建特异性的DNA探针。