• 广义的遗传工程：包括细胞工程、染色体工程、
•
细胞器工程、基因工 程。
• 狭义的遗传工程：即基因工程
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•
• 2.基因工程的发展：
基因工程的产生和发展在遗传学的发展史上是一次大革命，它打 破了种、属的界线，可以在生物大系统内交流基因。其发展情况如下：
• 1971年，史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶
• 二个平齐末端。
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三、载体
• 载体是将“目的”基因即重组DNA分子导入受体细胞的运载 工具。
DNA载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色 体等，现在使用的载体都是采用基因工程的方法构建的。
• 载体的条件：
①.具有复制原点，能自我复制，并能带动携带的外源
DNA一起复制。
②.具多克隆位点，即有多种限制酶的切点；且切点不存
在于复制原点或抗性选择标记内，即切点不影响复制和标记
性状的表现。
③.至少有一个选择标记基因，便于鉴定进入宿主细胞与
否，如抗生素基因或某种酶的基因，而宿主细胞没有这些基
因。
④.易从宿主细胞中回收克隆。
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• 一些常用的载体：
• ㈠、细菌质粒 ：
• 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然 存在的、能自我复制、易分离和导入的环状 双链DNA分子，是质粒具有重组表型检测标 记，可检测是否携带外源DNA片段。
⑥．从繁殖的大量细胞群体中筛选和鉴定含有目标基因 的重组DNA，受体细胞的克隆；
•
⑦. 能从选出的宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重
组的DNA分子；
• 2020/6/28⑧.克隆的基因能够正常表达。
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二、限制性内切核酸酶
• 限制性内切核酸酶，是一种核酸水解酶，主 要从细菌中分离得到，这些酶能识别特定的
•
（如α–互补的显色表型）
•。
•
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③ lacZ的肽互 补
1）-肽（ lacZ’ ）：
-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸）。
4聚体
N端的11-41aa N端的11-41aa N端的11-41aa N端的11-41aa
C端大部分 C端大部分 C端大部分 C端大部分
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• ⑵．限制性内切酶的类别： 根据限制性内切酶的作用特点，可分为两类：第Ⅰ 类酶、第Ⅱ类酶
• 第Ⅰ类酶 ： • 如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分
子量较大(约300，000)， 由于这类酶的切割部位无 特异性，是随机的，每隔一段DNA 序列随机切割双 链DNA分子，切割点不固定，所以在基因工程中很 少应用。 第Ⅱ类酶（）：
5’ MCS lacZ’
3’ 5’ 外源DNA lacZ’ 3’
肽 互补
肽移码突变 不互补
④ IPTG的诱导作 用
IPTG 是 乳 糖 的 类 似 物 。 能 诱 导 lac 操 纵 子的启动转录，使受体菌基因组中的 lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都表 达。从而互补。 但载体MCS上插入外源DNA后，仍然 不能产生肽！
DNA的体外重组：
• 1. 体外通过限制性内切酶的修剪和DNA连接酶的连接； • 2. 目标DNA分子+载体DNA，共价连接； • 3. 获得重组DNA分子。
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• ㈠、从基因库中分离基因：
1. 基因库（gene library）： 是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体
。从基因库中分离基因，首先要构建基因库 。
的转录水平，检测mRNA的存在。
• ③. Western 杂交分析：用于蛋白质的分
析。
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• ㈡、PCR扩增基因：
聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)可以体外快速 扩增DNA。
美国Mullis(1986)发明 (现代生物学发展史上的里程碑)。 PCR反应三个步聚 (一个循环)： 1. 变性：94－95℃使模板DNA双链变成单链； 2. 复性：50－70℃下，引物分别与互补DNA单链互补配对； 3. 延伸：在引物的引导和Taq酶作用下，72 ℃下合成模板DNA的互 补链。 PCR反应通常有25－35个循环，一般可扩增5kb左右的片段。㈢、
化学合成的方法人工合成基因；
③．将DNA片段或人工合成的基因与能够自我复制并 具有选择标记的载体在体外连接，形成重组DNA分子；
④．将重组的DNA分子引入受体（宿主）细胞中，使 重组DNA分子在受体细胞内复制，产生多个拷贝，即克隆 ；
⑤．重组DNA能随宿主细胞的分裂而分配到子细胞中 ，使子代群体细胞均具有重组的DNA分子的拷贝；
如EcoR I(大肠杆菌)、Hind Ⅲ(嗜血杆菌)，分子 量较小(约 20，000-100，000)， 这类酶的切割部 位有特异性，可准确切割DNA双链的特异序列，因 此在基因工程中广泛应用。
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• 这类酶的切割点是对称序列。如回文对称 序列（又称反向重复序列，即从两个方向 阅读，其序列相同的序列）。识别特定的 碱基序列，交错切割产生二个粘性末端。
（其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位于 选择标记Tetr的内部）
抗菌素选择原理
含有抗菌素的培养基（选择培养基）中 能够生长抗菌素抗性基因的受体菌
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌 后，受体菌才能生长。
抗性基因
死
抗菌素
活
• 另：pUC18质粒具有以下特点：
①. 分子量小，可接受较大外源片段； ②. 拷贝数多，500个／细胞； ③. 克隆位点的酶切位点多，克隆方便； ④. 具有用于检测重组质粒的选择标记
根据克隆核酸序列、来源，基因库可分 为：核基因库、染色体库、cDNA库、线粒体 库等
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• ①. 核基因库 ： 核基因库(genomic library)：将某生物全部基因组DNA入感受态细胞 收集菌落。 噬菌体或柯斯质粒 (cosmid)载体：将重组DNA包装进噬菌体 感染细
菌 收集噬菌斑。 BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)载体：重组人工染色
体 导入宿主细胞 收集细胞。 ②. 染色体基因库：
将染色体用来构建基因库,可选择特异基因和分析染色体结构和组织。
• 如果蝇的多线染色体：对染色NA为模板反转录酶合成互补DNA 构建基因库。cDNA库与核
第九章 基因工程和基因组学
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• §1．基因工程(Gene engineering)
一、基因工程概述
• 1、基因工程的概念
• 20世纪70年代随着DNA重组技术的发展在遗传学上产生 了一门新的分支遗传工程（ Genetics engineering ）
• 遗传工程:又称遗传操作（Genetic manipulation）,是以 分子遗传学为 基础，以现代物理、化学等为手段，按照 人们设 计的生物蓝图在细胞、染色体和基因等不同水平 上，对生物的遗传性状进行定向改造，创造新的生物类型 。
DNA库不同：cDNA库仅具有细胞或组织内表达基因的mRNA序列 仅包 括基因组的部分基因序列。
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• 2. 筛选基因库：
根据待选基因相关信息 确定
• 筛选方法和条件
从基因库中筛选、
• 分离基因。多数方法是利用一段核苷酸
• 序列(DNA、cDNA或寡聚核苷酸)或抗体
• 作探针(Probe)，用放射性同位素或非放
•
酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。
1972年 伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体
•
DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来 得到新的DNA分子。
1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人
的胰岛素投放市场。
• 自从1983年第一株转基因烟草获得以来，至今已有120种植物转基因获 得成功。2019年全球大面积种植，并不断扩大。
IPTG
IPTG诱导的结果： MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。
通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是 否有DNA插入。
• ㈤、细菌人工染色体(bacterial artificial
chromosome，BAC)： BAC载体一般可携带大于50kb的外源
DNA片段。F因子改造成BAC载体，甚至可 用于克隆100kb以上的DNA片段。 • ㈥、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)：
• 射性同位素标记探针 筛选基因库。
•
筛库过程：
将噬菌体感染形成的噬菌斑印影在硝酸
• 纤维膜上变性 带有目的基因的放射性
• DNA或cDNA作探针进行杂交 放射性
• 自显影 杂交信号（黑点）对应的
• 噬菌斑即为阳性克隆。
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• 3. 阳性克隆的分析与鉴定： 从基因库中筛选出阳性克隆， 分析、鉴定，得到目的基因 。 ⑴. 限制性酶图谱： 根据同源性分析，了解 阳性克隆片段的酶切位点及 相对位置 用于进一步亚 克隆或同已知的其它序列比 较。
核苷酸序列， 所以称之为限制性内切酶。是 基因工程的常用工具酶。
• ⑴．限制性内切酶的命名： 根据其来自的生物名称，用英文字母和数字 表示；
①. EcoR I 来自大肠杆菌（Escherichia coli）；
②. Hind Ⅲ来自嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）。
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3）载体lacZ’与互补
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码肽与这个 缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使 它能形成4聚体，从而能分解X-gal，产 生蓝色物质。