可逆性抑 制作用
抑制剂通常以共 价键与酶活性中 心或活性中心以 外的必需基团相 结合，使酶失活 。
抑制剂通常以非 共价键与酶或酶 -底物复合物可 逆性结合，使酶 活性降低或消失 。
可逆性抑制作用
竞争 竞争性 性
非竞争 非竞 性
Km增大
争性
Vmax降低
反竞争 反竞 性
争性
Km, Vmax降低
底物浓度对酶促反应速度的影响
pH 对反应速度的影响
在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性 通常称 酶具有最大的催化活性,通常称 在一定的 此pH 为最适 pH。 。
激活剂对反应速度的影响
酶的激活剂
必需激活剂， 必需激活剂， 大多为金属离 ＋ 子，Mg2＋，K＋ ＋ ，Mn2＋，等
非必需激 活剂
抑制剂对反应速度的影响
不可逆性 抑制作用
酶促反应动力学 实验
影响酶促反应速度的因素
酶浓度 B 底物 浓度 A 酶促反 应速度 F 抑制剂 E C D pH值 pH值 温度
激活剂
酶浓度对反应速度的影响
底物浓度 >酶浓度 >酶浓度
酶被底物 饱和
正比例 关系
温度对反应速度的影响
一方面是温度升高, 一方面是温度升高 酶促反应速度加快。 酶促反应速度加快。 另一方面,温度升高 温度升高, 另一方面 温度升高 酶的高级结构将发 生变化或变性， 生变化或变性，导 致酶活性降低甚至 丧失。 丧失。 在最适温度条件下, 在最适温度条件下 反应速度最大。 反应速度最大。
Lineweaver-Burk Plots of Inhibited Enzymes
实验原理
磷酸苯二钠 碱性磷酸酶
H2O pH=10.0， 37℃
酚 OH－
Na2HPO4
酚试剂 磷钼钨酸） （磷钼钨酸）
650nm 蓝色化合物 吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸 光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐 标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。
试剂
1．酚试剂 2．2.5mmol／L磷酸苯二钠基质液 3．碱性缓冲液(pH-10.0) 4．碱性磷酸酶液
米氏常数的求法
1
V
× [S] + = V max
V表示酶促反应速度 Vmax表示酶促反应最大速度
[S]表示底物浓度
Km
1
1
Vmax
Km表示米氏常数
双倒数作图法
底物浓度对酶活性 的影响
——碱性磷酸酶Km 值的测定
米氏常数是酶促反应动力学中的一个相当重要的 常数，通过实验， 常数，通过实验，可理解并掌握利用实验求出 Km的方法。 的方法。 的方法
处理结果
管号 1 2 3 4 5 6 7 A650 1/A650 [S] 1/[S]
以1/A650对1/[s]按Lineweaver-Burk作图法作 图，求出碱性磷酸酶的Km
在竞争性抑制中，酶不能同时和底物、抑制剂结合， 在竞争性抑制中，酶不能同时和底物、抑制剂结合， 即不能形成EIS，I竞争结合酶活性中心，其动力学特征 竞争结合酶活性中心， 即不能形成 ， 竞争结合酶活性中心 米氏常数的表观值Km增加 酶的最大反应速度Vm 增加， 是：米氏常数的表观值 增加，酶的最大反应速度 不变。。 不变。。 在非竞争性抑制中，抑制剂、 在非竞争性抑制中，抑制剂、底物都能同时和酶结合形 结合酶活性中心以外部位， 成EIS， I结合酶活性中心以外部位，不影响 与S之间 ， 结合酶活性中心以外部位 不影响E与 之间 的结合，但是EIS不能进一步转变为产物 不能进一步转变为产物， 的结合，但是EIS不能进一步转变为产物，其动力学特 征是： 降低而 不变。 降低而Km不变 征是：Vm降低而 不变。 在反竞争性抑制中， 在反竞争性抑制中，抑制剂必须在酶和底物结合以后 才能和酶结合形成EIS，其动力学特征是；Km和Vm都降 才能和酶结合形成 ，其动力学特征是； 和 都降 低。 上述三种抑制类型， 上述三种抑制类型，可在抑制剂存在下通过动力学特征 图形判断
当反应速度等于最大速度 一半时,即 一半时 即V = 1/2 Vmax, Km = [S] 上式表示,米氏常数是反应 上式表示 米氏常数是反应 速度为最大值的一半时的底 物浓度。 物浓度。 因此,米氏常数的单位为 因此 米氏常数的单位为 mol/L。 。
即为米氏常数， Km 即为米氏常数，
Vmax为最大反应速度
低 高
反应速度和底物浓 度
反应速度增 底物度 的增高 酶 底物 和
研究前提
单底物、单产物反应 酶促反应速率一般在规定反应条 件下，用单位时间内底物的消耗 量或产物的生成量来表示。 反应速率取其初速率，即底物的消 耗量很小(≤5%)时的反应速率。 底物浓度远远大于酶浓度。
矩形双曲线
米－曼氏方程式
操作
试剂(ml) 2.5mM磷酸苯二钠 蒸馏水 碱性缓冲液 碱性磷酸酶液 酚试剂 碱性磷酸酶液 10％ Na2CO3
取8支试管，按下表加入试剂。
1
0.2 0.8 1.0
2
0.3 0.7 1.0
3
0.4 0.6 1.0
4
0.5 0.5 1.0
5
0.6 0.4 1.0
6
0.8 0.2 1.0
7
1.0 1.0
8
1.0 1.0
混匀后，370C水浴 5 min
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 -
混匀后，370C水浴 15 min（准确计时）
1.0 3.0 1.0 3.0 1.0 3.0 1.0 3.0 1.0 3.0 1.0 3.0 1.0 3.0 1.0 0.1 3.0
混匀后，37℃水浴15min，以第8管调节零点， 在650nm波长处进行比色，读取各管A值。
米氏常数Km的意义
不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重 要的特征物理常数。 要的特征物理常数。 值只是在固定的底物， Km值只是在固定的底物，一定的温度和 pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不 条件下，一定的缓冲体系中测定的， 条件下 同条件下具有不同的Km值。
Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值 值表示酶与底物之间的亲和程度： 大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km 大表示亲和程度小，酶的催化活性低
值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。 值小表示亲和程度大 酶的催化活性高。 酶的催化活性高
Vmax
定义： 是酶完全被底物饱和时的反应速度， 定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度， 与酶浓度成正比。 与酶浓度成正比。 意义： 意义：Vmax=K3 [E] 如果酶的总浓度已知，可从 如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶的 转换数(turnover number)，即动力学常数K3。 转换数 ，即动力学常数