分子克隆技术实验讲义黑龙江大学生命科学学院2016年3月甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定一、实验目的1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。

2、学习和掌握质粒、T载体的特点。

3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。

4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。

5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。

6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。

7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。

8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。

二、相关知识（一）T载体的制备pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（T-A Cloning）的商业化专用载体，由pΜC 18载体改建而成。

在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoRⅤ识别位点，用EcoRⅤ进行酶切反应后，再左两侧的3′端添加“T”而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

相关知识点：（1）质粒的提取；（2）酶切；（3）PCR等。

（二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆）把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。

所谓重组，就是把外源目的基因“装进”载体的过程，即DNA的重新组合。

为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端（compatible end），以产生末端连接。

现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。

相关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2）DNA重组；（3）内切酶；（4）粘性末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶的分类及功能等。

（三）大肠杆菌感受态细胞的制备外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。

受体细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。

感受态细胞（competent cell）是经过一定方法处理后，具有接受外源DNA能力的大肠杆菌，只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。

相关知识点：（1）克隆；（2）宿主细胞的定义及分类；（3）感受态细胞定义及其功能；（4）转化定义及方法（DMSO、MnCl2、TB aq、PEG）等。

（四）重组DNA的转化及重组子的鉴定将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。

把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两个目的，一是大量产生重组DNA分子，在完成连接反应后，重组DNA分子往往只有纳克级的量，不易操作和进行下一步的分析，若把重组DNA分子导入到细菌细胞中，细菌细胞可分裂多次产生克隆，克隆中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNA分子，这样重组DNA分子的量就多了；二是对重组DNA 分子进行纯化，在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子，连接过程完成以后体系中有多种分子存在，除了需要的重组DNA分子以外，还含有没有连接上的载体分子、没有连接上的DNA片段、自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段的重组DNA分子，未连接上的载体和DNA片段对实验影响不大，因为它们即使导入细菌细胞，因为不能复制，很快就要被细菌细胞中的酶降解掉；对克隆工作带来影响的是后两种分子，因为它们都为环状，在细菌细胞中都能复制，因而都能产生克隆，但是每个细胞中只能导入一个质粒DNA分子，每个单克隆都是由一个细胞形成的，因此在每个克隆中所有的细胞都只含有同一种质粒。

所以只要对不同的克隆进行筛选，就可以鉴定所需的重组DNA 分子。

所谓的重组子（recombinant）也叫做转化子（transformant）是指吸收了重组DNA分子的转化细胞。

将重组子从其它细胞群中（如上面提到的对克隆影响较大的自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段）分离出来，并鉴定无性繁殖的外源基因确实为目的基因，这过程称为筛选（screening）。

根据载体体系、宿主细胞的特性以及外源基因在受体细胞表达情况的不同，初步把筛选方法分为直接筛选和间接筛选，直接筛选法又可进一步分为DNA鉴定筛选法、选择性载体筛选法、分子杂交选择法；间接筛选也可以进一步分为免疫学方法、mRNA翻译检测法；本试验采用平板筛选法中的蓝白筛选法。

相关知识点：①转化（transformation）质粒（plasmid）②转染(transinjection) 噬菌体（phage）③显影注射（1）导入的方法④电转化 2.5kv⑤基因枪geneblaster⑥脂质体介导法⑦其它方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法（2）重组子：转化子（3）重组反应体系中的成分：①②③④⑤⑥（4）筛选的方法DNA鉴定筛选法：定位、测序①直接筛选法选择性载体筛选法：λph包裹、抗药性α-互补分子杂交筛选法：ISH、Southern Blot免疫化学免疫学方法②间接筛选法酶免疫检测mRNA翻译检测法（五）质粒DNA的提取（碱裂解法）原核生物没有真正的细胞核，DNA一般位于一个类似“核”的结构——称为类核体上（因为不是一个完整的细胞核）。

E.coli的遗传物质主要是染色体DNA ，E.coli的染色体为双股环状DNA，含有 1 400个以上的基因，另外还有一些质粒DNA。

1、质粒的概念质粒是细菌（如 E.coli）染色体外的小型环状双链DNA分子。

一般说来，质粒不是细菌生长繁殖所必须的结构，就细胞生存而言，质粒是可有可无的。

质粒分子本身含有复制功能的遗传结构，故能在细菌内独立地进行复制，并在细胞分裂时恒定地遗传给子代细胞。

2、研究质粒的意义（1）质粒作为一种裸露的，比病毒更简单、更有自主复制能力的DNA分子，正好处于生命与非生命的分水岭上。

由于质粒能够复制、能够传递、能够表达其遗传信息，说明质粒是独立的有机体，是亚细胞生命体系的成员，是比病毒更简单的原始生命形态，所以质粒是研究生命起源的一块重要的基石。

（2）要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具。

携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体。

由于质粒具有遗传传递和遗传交换的能力，因此，质粒作为基因工程的重要运载工具，在现代分子生物学占有重要地位。

3、质粒的分类不同的质粒在宿主细胞中的拷数也不同，根据质粒在细胞中拷贝数的多少，Rownd（1969）把质粒分为严密型质粒和松弛型质粒。

（1）严密型质粒（stringent plasmid）：严密型质粒多半是一些具有自身传递能力的大质粒，其DNA 的复制与宿主染色体DNA的复制相偶联，受到某种程度的控制，每个细胞仅有1-2个拷贝。

（2）松驰型质粒（relaxed plasmid）：松驰型质粒多半是分子量较小、不具传递能力的质粒，其复制是在松驰控制下进行的，每个细胞的拷贝数约为10～200个。

当向培养基中加入氯霉素时，细胞的蛋白质合成被抑制，细胞染色体DNA和严密型质粒DNA的复制停止，松驰型质粒DNA的复制继续进行。

松驰型质粒DNA的拷贝数可达数百个，基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒。

相关知识点：（1）质粒的分类：①与宿主相关程度：严密型质粒（stringent plasmid）、松弛型质粒（relaxed）②是否有转移基因：接合型质粒、非接合型质粒③带有特殊用途的基因：生殖质粒（F质粒）、抗性质粒（R-质粒）、col质粒（编码杀死其他细菌的蛋白质）、降解质粒、致病质粒（Ti）（2）质粒的提取方法：煮沸法、CsCl、试剂盒、碱裂解法；（3）质粒的构型：①SC构型：cccDNA (covalently closed circle DNA)②OC构型：ocDNA (open circle DNA)③L构型：L-DNA (linearDNA) O L S三、实验原理（一）T载体的制备XcmⅠ是一种Ⅲ型的限制性核酸内切酶，其识别序列为：5′-CCANNNNN^NNNNTGG-3′3′-GGTNNNN^NNNNNACC-5其中阴影部分为XcmⅠ的识别序列，“^”为XcmⅠ的切割位点，其识别序列中间的9个任意核苷酸（N）对XcmⅠ的酶切特异性及酶切效率没有影响。

为了能得到用XcmⅠ酶切后3′末端均是T的载体，本实验利用了XcmⅠ的识别序列的特点，引物的3′端带有XcmⅠ酶切位点，其序列如下：Primer1：5′-CGCCCATGCTA^GCGCTGGTAAT- 3′Primer2：3′- TCTCTAAGGTA TGC^A TATGACCCGC- 5′引物中“^”为XcmⅠ的切割位点，当XcmⅠ对PCR得到的线性片段进行酶切的时候，便会产生一个与T 载体形式完全一样的3′-T粘性末端。

（二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆）1988年，Clarke发现所有的PCR产物都在Taq DNA聚合酶的作用下在3′端附加上了一个3′突出的腺苷酸，因为Taq DNA聚合酶具有非模板介导的核苷酸转移酶活性，可在双链DNA末端加上一个单一的3′突出的dATP，利用Taq DNA聚合酶的这一特性，在克隆载体上附加3′胸腺嘧啶（dTTP）形成T-A 克隆系统，即可直接对PCR产物进行有效的克隆，这样的载体称为T-载体。

（三）大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备技术是从20世纪70年代初期发展起来的，当时人们发现如果把 E.coli 细胞浸在一冰冷的盐溶液，它吸收DNA分子的能力要比不浸的细胞强；经过摸索和总结，人们终于采用50 mmol/L的氯化钙（CaCl2）溶液来制备感受态细胞。

其他的盐（如氯化铷RbCl）也很有效。

尽管对这一处理的确切机制仍不清楚，但有人对感受态提出了两种假说，一种认为是细菌细胞壁的局部失去了壁结构或局部溶解，让外源DNA分子通过质膜进入；另一种认为DNA分子能进入细菌细胞是由于细胞处于感受态时表面形成了一种可接受DNA的酶位点。

一旦细胞被处理制备成感受态细胞，它们就能稳定地摄取外源DNA分子了。

（四）重组DNA的转化及重组子的鉴定转化是使重组体DNA分子在热休克的短暂时间内被导入受体。

一般认为DNA分子在转化过程中将经历四个阶段，第一个阶段是吸附阶段，完整的双链DNA分子将吸附于感受态细胞的表面；第二个阶段为转入阶段，双链DNA分子解链，以单链的形式进入细胞，而另一链则被降解；第三阶段是自身稳定阶段，外源质粒在细胞内又复制成双链环状DNA；第四个阶段是表达阶段，即目的基因随同质粒的复制子一起复制。