继续发生反应，这种短片段可以
在纯化时分离掉。
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第四步：在氧化剂碘的作用
下，亚磷酰形式转变为更稳定
第一个循环结束
的磷酸三酯。
后期处理
经过以上四个步骤，一 个脱氧核苷酸被连接到
2
固相载体的核苷酸上。 再以三氯乙酸脱去它的 5'-羟基上的保护基团 DMT，重复以上步骤， 直到所有要求合成的碱
A
可以开始了
CP G
第二步：合成DNA的原料，
亚磷酰胺保护核苷酸单体，与
活化剂四氮唑混合，得到核苷
亚磷酸活化中间体，它的3'端
被活化，5'-羟基仍然被DMT保
护，与溶液中游离的5'-羟基
发生缩合反应。
DM T
P
A
核苷酸与亚磷酰 胺，和活化剂四 氮唑混合，核苷 酸3’上的氢被 亚磷酰胺取代形 成核苷亚磷酰胺 活化中间体
具有高效、快速的偶联以及
起始反应物比较稳定的特点。
详细步骤：
第一步：将预先连接在固相载体
CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三
氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基
团DMT，获得）
DM H T
将核苷酸 固定在载 体上
P
在三氯乙酸作用下， 在某反应下，磷酸基 脱去DMT产生游离的 团被DMT取代以保护 羟基 5‘端的羟基
原理：
将核苷3'固定在固相载体（如CPG，可控微
孔玻璃珠）上,并在5'上连接一个保护基团DMT,使
合成的方向由待合成引物的3'端向5'端合成的。
相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。 每个循环过程中都经过高效率且化学 性质活泼的核苷酸3′-亚磷酸酰胺中间体， 其氧化后成为稳定的五价磷酸三酯。
特点：
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合 成效率。
基被接上去。
1
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下 来，通过OPC,page等手段纯化引物，成品引物用 C18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮， 测定OD260定量，根据定单要求分装。
3
参考资料
1.亚磷酰胺法 ．全国科学技术名词审 定委员会[引用日期2015-01-23] 2.引物是如何合成的 ．生物 帮．2012-04-01[引用日期2015-0123]
亚P
DM T
P
A
之后产生的 H 亚P 核苷亚磷酸酰 胺活化中间体 3’端的亚磷酸 基团与第一步 制好的固相载 体的5’端活化 的羟基缩合
P
CPG
A
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第三步，带帽(capping)反应，
缩合反应中可能有极少数5'-羟 基没有参加反应(少于2%)，用 乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后
3.《环球科学》杂志：组装生命的生 物工厂
Thank you!
目前最常用的DNA自动化固相合成方法— —固相亚磷酰胺法
固相 亚磷酰胺法
演讲：某某某 PPT: 某某某 资料查找：某某某 某某某
发明者：
背景：
Marvin H. Caruthers （马文·H·卡拉瑟斯）
美国国家科学院院士，美国 科罗拉多大学化学及生物化 学系教授。 1968年，在西北大学获得博 士学位。现主要从事核酸化 学和生物化学，利用DNA自身 的化学性质，研发出一种单 链DNA合成法。 1987年，发明‚固相亚磷酰 胺法‛。 1994年，被授予美国国家科 学院院士。