第三章 细胞生物学研究方法第一节 细胞形态结构的观察方法分辨率： 肉眼0.2mm 光镜0.2μm 电镜0.2nm一、光学显微镜技术 （light microscopy ）（一）普通复式光学显微镜技术a ． 光学放大系统：目镜和物镜光镜 照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片组成 机械和支架系统b ．分辨率D ：分开两个质点间的最小距离。

0．61 λ 其中： λ为光源波长D ＝ α为物镜镜口张角N ·sin α/2 N 为介质折射率c.普通光镜样品制备： 固定（如甲醛）、包埋（如石蜡）、切片（约5μm ）、染色（二）荧光显微镜技术（fluorescence microscopy 光镜水平对特异蛋白定性定位）1． FM 包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术2． 不同荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上荧光素标记。

荧光显微镜中只有激发荧光可以成像。

（三）激光共焦点扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscopy ）1．特点：瞬间只用很小一部分光照明，保证只有来自焦平面的光成像，成像清晰分辨率比普通荧光显微镜提高1.4－1.7倍。

通过改变焦平面位置可以观察较厚样品的内部构造，进行三维重构。

2． 共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。

（四）相差和微分干涉显微镜技术1．相差显微镜（phase-contrast microscopy ）光线通过不同密度物质产生相位差，相差显微镜将其变成振幅差。

它与普通光镜的不同是其物镜后有一块“相差板”，夸大了不同密度造成的相位差。

2．微分干涉显微镜（differential －interference microscopy ）——用的是平面偏振光 光经棱镜折射成两束，通过样品相邻部位，再经棱镜汇合，使样品厚度上的微小 差别转化为明暗区别，使样品产生很强的立体感。

二、电子显微镜技术（electron microscope ）（一） 电子显微镜基本知识1．与光镜的基本区别：电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜筒高真空、荧光屏等成像2．分辨本领与有效放大倍数： 分辨率0.2nm ，比肉眼放大分辨本领指电镜处于最佳状态下的分辨率。

实际情况中，分辨率受样品限制。

3．电子显微镜 电子束照明系统：电子枪、聚光镜基本构造 成像系统：物镜、中间镜、投影镜等真空系统：用两级真空泵不断抽气记录系统：荧光屏或感光胶片成像（二） 主要电镜制样技术介绍制样要求：①要求样品很薄（数十纳米） ②要求保持精细结构1．超薄切片技术①固定：保持样品形态结构，甚至超微和分子水平上结构。

固定剂：常用饿酸（OsO 4）和戊二醛等，另外有物理方法如高频微波。

②脱水③包埋：使样品中各种细微结构得到支撑，使切片连续完整并有足够强度。

包埋剂常用环氧树脂。

④切片：厚度40-50nm，通过样品杆的金属热膨胀或机械伸缩来控制。

切片刀：玻璃或钻石刀，常用玻璃刀。

切片置于覆有支持膜的载网上。

⑤染色：用重金属盐染色。

如锇酸染脂肪、铅盐染蛋白质、醋酸铀染核酸等。

通过电子束振幅的改变只能得到黑白图像。

还可以与其他技术结合。

2．负染色技术（negative staining）用的是重金属盐，如磷钨酸或醋酸双氧铀，载网上铺上重金属盐，衬托出样品。

3．冷冻断裂和冷冻蚀刻电镜技术冷冻断裂：快速低温冷冻样品（液氮或液氦中），然后样品在其结构相对脆弱的部位断裂。

用另一些方法增强效果。

冷冻蚀刻（freeze etching）：主要用来观察膜断裂面的蛋白颗粒和膜表面结构，不需包埋也不需固定。

冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching）4．电镜三维重构技术基本步骤：对生物样品在电镜中的不同倾角下拍照，得到的电镜图片再经变换处理形成复合物三维结构的电子密度图。

低温电镜技术、玻璃态、结构生物学。

5．扫描电镜技术（scanning electron microscope，SEM）主要用来观察样品表面的形貌特征，用CO2临界点干燥法解决表面张力问题。

扫描电镜景深长，成像具有强烈的立体感。

分辨本领可达0.7nm 。

三、扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM）利用量子力学中的隧道效应观测物质表面的形貌。

主要装置：XYZ三个方向扫描的压电陶瓷、逼近装置、电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。

主要特点：①原子原子尺度的高分辨本领，侧分辨率0.1-0.2nm,纵分辨率0.001nm②可以在真空、大气、液体等多种条件下工作。

③非破坏性测量。

原子力显微镜（atomic force microscope）等十余种扫描探针显微镜。

第二节细胞组分的分析方法一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物差速离心（differential centrifugation）：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。

密度梯度离心：将要分离的组分铺放在含有密度逐渐增加的、形成密度梯度的、高溶解性的、惰性物质溶液表面进行离心，形成不同的沉降带。

二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法利用显色剂与被检物质的特殊基团反应显色来判断。

DNA：福尔根（Feulgen）反应特异显示DNA分布。

多糖：PAS反应（即醛基与希夫schiff试剂反应呈紫红色）脂肪酸：四氧化饿（结果呈黑色）、苏丹Ⅲ（深红色）、苏丹黑蛋白质：很多检测方法，如米伦（Millon）反应（红色沉淀）、重氮反应、“－SH”酶：大多数固定剂对酶有钝化作用，定性研究时，保持酶活性，与适宜底物温育。

三、特异蛋白抗原的定位与定性胞内蛋白定位：免疫荧光与免疫电镜蛋白质体外分析定性：免疫印迹和放射免疫沉淀。

（一）免疫荧光技术（immunofluorescence technique）定义：将免疫学方法与荧光标记技术相结合来研究特异蛋白抗原在体内分布的方法。

主要包括：荧光抗体的制备、标本的处理、免疫染色和观察记录等过程。

一个概念：免疫酶标记技术（即以酶代替荧光素与抗体偶连）。

（二） 免疫电镜技术该技术同样用抗原抗体反应的原理，能有效提高样品分辨率，在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。

免疫电镜技术可分为：免疫铁蛋白技术、免疫酶技术与免疫胶体金技术四、细胞内特异核酸序列的定位与定性采用原位杂交技术（in situ hybridization ）：用标记的核酸探针确定特殊核苷酸序列。

光镜下原位杂交：放射性同位素或荧光素标记探针电镜下原位杂交：生物素标记探针，检测通过抗生物素抗体上的胶体金颗粒。

五、利用放射性标记技术研究生物大分子在细胞内的合成动态1．放射自显影技术：利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。

2．这一技术的独具特征：对细胞内生物大分子的动态研究和追踪（pulse －chase ）3．两个主要步骤：①同位素标记的生物大分子前体的掺入②胞内同位素位置显示4．不同的放射性同位素及其选择（P64）5．显微放射自显影的基本步骤：标记（持续或脉冲） 制片 敷胶（3－10μm ） 曝光 显影和定影 显微镜下观察6．电镜放射自显影技术：与显微自显影不同的是样品制备与敷胶的要求更为严格。

六、定量细胞化学分析技术（一） 显微分光光度测定技术（microspectrophotometry ）该技术利用细胞内某些物质或物质经染色后对特异光谱的吸收对其进行定量测定。

包括：紫外光显微分光光度测定法和可见光显微分光光度法。

以上方法各自的原理（P65）（二） 流式细胞仪（flow cytometry ） P65底第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养（分原核生物细胞、真核单生物细胞、植物与动物细胞以及病毒的培养）（一）动物细胞培养1． 原代细胞（primary culture cell ）：从有机体取出后立即培养的细胞。

传代细胞（subculture cell ）：适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞。

2．原代培养步骤：组织块 胰酶或胶原酶与EDTA 良好的培养环境中（有小牛血清）转动培养3．单层细胞培养：分散呈圆球形的细胞一经贴壁就迅速铺展并开始有丝分裂，逐渐形成细胞单层，成为单层细胞（single layer cell ）。

4． 10代 40－50代 无限制原代细胞 细胞株（cell strain ） 细胞系（cell line ）几个有名的细胞系：Hela 细胞系、BHK21（baby hamster kidney ）细胞系、CHO（chinese hamster ovary ）细胞系。

5．体外培养细胞的形态：成纤维样细胞（fibroblast like cell ）、上皮样细胞6．悬浮方法培养：某些传代细胞。

这一方法的优点：同时获得大量细胞。

（三） 植物细胞培养 （分单倍体细胞培养和原生质体培养）单倍体细胞培养 ①小孢子 胚状体 单倍体植株主要用花药 ②愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。

原生质体培养：①用纤维素酶去壁为原生质体，无菌培养、诱导分化为植株。

用植物体细胞②不同植物原生质体融合，由此获得体细胞杂交的植株。

（四）非细胞体系在细胞生物学研究中的作用（P67－68）非细胞体系：来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需的物质（如功能系统和酶反应体系等）组成的体系。

二、细胞工程（cell engineering）主要技术：细胞培养、细胞分化的定向诱导、细胞融合和显微注射等。

（一）细胞融合与细胞杂交技术1．细胞融合定义：两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象。

2．动物细胞融合：灭活的病毒（如仙台病毒）或化学物质（如聚乙二醇）介导植物细胞融合：要先用纤维素酶除去纤维素壁。

3．电融合技术（electrofusion method）：低压交流电场中聚集，高压电脉冲下融合。

4．同核融合细胞（homokaryon）：基因型相同的细胞融合，同步有丝分裂产生有大核的单核子细胞，称为融合核细胞（synkaryon）。

异核融合细胞（heterokaryon）：基因型不同的种内或种间细胞融合（二）单克隆抗体技术（monoclonal antibody）1．基本原理：将B淋巴细胞和肿瘤细胞融合成杂交瘤细胞，该细胞具有两种亲本细胞的特性，一方面可以分泌抗体，另一方面可以无限增殖。

2．该技术的优点：可以用不纯的抗原分子制备纯一的单克隆抗体。

因为产生特异抗体的杂交瘤细胞株可以被分离。

（三）细胞拆合与显微操作技术（P70-71）1．细胞拆合：把核和质分离开来，然后把不同来源的细胞质和细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。

物理法：用机械方法去核或短波光把细胞核去掉或使之失活，然后用微管吸取其他细胞的核，注入去核的细胞质中，组成新的杂交细胞。