免疫荧光双标记在心肌石蜡切片中的应用陈绪军肖明第吕志前卢成宝薛松袁忠祥徐根兴作者单位：200080 上海市第一人民医院心血管外科细胞性心肌塑型术（cellular cardiomyoplasty）用于缺血性心肌病的治疗受到人们越来越多的关注［1］，在证实移植的人干细胞在缺血/损伤的环境中分化为人心肌细胞方面，免疫荧光技术的运用逐渐增多，但多用的是新鲜冰冻切片，在石蜡心肌切片中应用较少，而且多是单一抗原的荧光标记［2］。
有研究表明，酪胺信号放大( tyramide signal amplifications, TSA)技术可以提高反应的灵敏性［3］。
为此，我们以人心肌石蜡切片标本为例，运用TSA－免疫荧光法与常规间接免疫荧光法分别对人心肌连接蛋白(connexin-43，Cx-43)蛋白及肌凝蛋白（myosin）进行标记，旨在为心肌石蜡切片建立一个免疫荧光双标记的方法。
一、材料与方法1. 主要试剂：兔抗人肌凝蛋白（myosin）多克隆IgG抗体购自美国Chemicon 公司，标记异硫氰酸酯荧光素（FITC）的驴抗兔多克隆IgG抗体与标记有辣根过氧化物酶（HRP）的驴抗小鼠多克隆IgG抗体均购自美国Jackson Immunity 公司, 小鼠抗人Cx-43单克隆抗体、碘化丙啶(PI)与牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma 公司，酪胺 (tyramide)-coumrian 结合物试剂盒购自美国PerkinElmer公司。
2．标本的取材、固定、切片及抗原修复: 人心肌取自一例6岁先天性心脏病小孩右房耳，中性福尔马林固定，4°C过夜固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，5 μm石蜡切片。
石蜡切片常规脱蜡、梯度酒精浸泡后行抗原修复：浸入0.01 mol/L的柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中，95℃，浸泡30 min, 室温冷却10 min。
3．Cx-43的免疫荧光标记：采用TSA-免疫荧光法［4］，按试剂盒说明书进行。
磷酸盐缓冲液（PBS）室温洗涤2次，每次5 min。
置入3% 过氧化氢/甲醇溶液中，室温，孵育10 min。
再室温PBS洗涤3次，每次5 min。
3%的BSA室温孵育30 min。
加入小鼠抗人Cx-43单克隆IgG抗体，4℃孵育过夜。
TnT缓冲液（0.1 mol/L Tri-HCI, pH 7.5, 0.15 mol/L NaCl, 0.05% 吐温-20）室温洗涤3次，每次5 min。
加入标记有HRP的驴抗小鼠IgG抗体，室温孵育1 h。
TnT液室温洗涤3次，每次5 min。
配制酪胺-coumrian 工作液：将酪氨-coumrian 结合物加入放大缓冲液中配成酪胺-coumrian 工作液（1∶50），避光，室温孵育15 min。
再次TnT液洗涤3次。
4． Myosin的免疫荧光标记：接上一步。
采用间接免疫荧光法［5］。
兔抗人肌凝蛋白多克隆IgG抗体（1∶20）， 37°C孵育1 h，PBS洗涤3次。
加入标记FITC的驴抗兔多克隆IgG抗体(1∶100)，避光，室温孵育1 h。
PBS室温洗涤3次，每次5 min。
5．PI染细胞核：加入碘化丙啶（PI/PBS，1 μg/ml），室温避光孵育3 min。
PBS室温洗涤3次后甘油封片。
6．荧光显微镜观察：运用带有3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜镜检：绿通道中观察FITC信号；蓝通道中观察coumrian信号；红通道中观察PI信号。
图像的编辑采用Advanced SPOT 软件。
二、结果在3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜中红、绿、蓝通道中分别可以观察到PI、FITC 及coumrian的信号，再经Advanced SPOT 软件叠加得到图1~4，红色代表PI标记的人心肌细胞核，绿色代表FITC标记的人心肌肌凝蛋白蛋白，蓝色为coumrian标记的人心肌Cx-43蛋白。
图1显示为未加myosin抗体而加Cx-43抗体的人心肌石蜡切片; 图2中均加myosin 抗体与Cx-43抗体; 图3中加myosin抗体而未加入Cx-43抗体；图4均未加入 myosin抗体与Cx-43抗体。
三、讨论1.心肌石蜡切片的免疫荧光双标记：在本研究中，图1与图2相比，人心肌石蜡切片中，不加myosin抗体的心肌纤维不着色，而加了myosin抗体的心肌纤维呈绿色，这表明心肌纤维被成功地标记上抗人myosin抗体，而且特异性高。
Cx-43蛋白位于心肌细胞的周围，在本研究中由图1、图2与图3可以观察到，加Cx-43抗体的人心肌Cx-43蛋白呈图1人心肌石蜡切片未加肌凝蛋白抗体而加Cx-43抗体，PI复染×200 图2人心肌石蜡切片均加肌凝蛋白抗体与Cx-43抗体，PI复染×200 图3人心肌石蜡切片加肌凝蛋白抗体而未加Cx-43抗体，PI复染×200 图4人心肌石蜡切片均未加肌凝蛋白抗体与Cx-43抗体，PI复染×200蓝色，而未加Cx-43抗体的人心肌Cx-43蛋白不着色, 这表明心肌成功被标记上抗人Cx-43抗体。
图2与图4相比，加入2种抗体，人心肌纤维与 Cx-43蛋白均着色，而不加抗体者均不显色；这说明本研究在人心肌石蜡切片中采用的免疫荧光双标记的方法是成功的，而且特异性高。
在本研究中，标记myosin 采用间接免疫荧光技术，这种方法较直接免疫荧光技术灵敏。
在本研究中，两种一抗分别来源于兔与小鼠，由于二抗是多克隆的，都可以与两种一抗结合，故必须是先标记Cx-43后再标记myosin，不能将两种二抗混合在一起加入，否则会出现交叉污染。
2.本研究方法有以下优点：（1）特异性较单荧光标记强。
在细胞性心肌塑型术中单荧光标记有一定的假阳性率，而采用本研究的双荧光法，能同时观察到移植的人的干细胞表达两种心肌抗原，假阳性率大大减低。
（2）目前，报道的人心肌免疫荧光双标记的方法较少，而且多需要特殊的设备如激光共聚焦扫描显微镜等［7］，本研究仅用普通的荧光显微镜就可以，易于掌握、使用方便。
3．心肌石蜡切片免疫荧光双标记的意义：成体心肌细胞再生能力非常弱［6］，移植干细胞到缺血/损伤的心肌内，以便参与心肌的修复与再生是当前国内外研究的热点［7］。
由于不同种属来源的干细胞的分化能力有较大的差异［8］，因此，人的干细胞在运用于临床之前，还需要将人的干细胞植入动物心肌内，以观察植入的人干细胞是否分化为人的心肌细胞［9］。
同新鲜冰冻切片相比，石蜡切片可以保持良好的组织形态，但在石蜡切片中运用免疫荧光检出抗原信号的灵敏性明显减低。
myosin是心肌肌纤维的重要组成部分，Cx-43又称为闰盘、缝隙连接蛋白。
如果观察到移植的人干细胞表达myosin与 Cx-43，那么就可以认定移植的人干细胞向人心肌细胞分化，而且可以在心肌细胞的电兴奋活动中与其他心肌细胞协同收缩［6］。
本研究建立了一种人心肌石蜡切片荧光双标记的方法，我们相信这种方法将在研究人的干细胞移植和心肌的修复与再生方面发挥重要作用。
参考文献1 Chen XJ，Xiao MD. Cell transplantation for heart repair. Guowai Yixue Sectionof Pathophysiol Clin Med，2003，23：47-49.陈绪军，萧明第.细胞移植修补心脏.国外医学生理病理与临床分册，2003，23：47-49.2 Kehat I, Kenyagin-Karsenti D, Snir M, et al. Human embryonic stem cells candifferentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest, 2001，108:407-414.3Howard M, Kaplan D. Applications of enzymatic amplification staining in immunophenotyping hematopoietic cells. Front Biosci, 2002，7:c33-43.4 Zaidi AU, Enomoto H, Milbrandt J, et al. Dual fluorescent in situ hybridizationand immunohistochemical detection with tyramide signal amplification. J Histochem Cytochem, 2000 , 48，1369-1375.5 Doucet L, Mendes F, Montier T, et al. Applicability of different antibodies forthe immunohistochemical localization of CFTR in respiratory and intestinaltissues of human and murine origin. J Histochem Cytochem. 2003 , 51:1191-1199.6 Chen XJ，Xiao MD. Myocardial cells can regenerate. Guowai Yixue Section ofCardiovascular Dis， 2002，29：199-202.陈绪军，萧明第.心肌细胞能够再生.国外医学心血管分册，2002，29：199-202.7 Chen XJ，Xiao MD. The proceedings of differentiations of stem cells intomyocardial cells. Guowai Yixue Section of Pathophysiol Clin Med, 2002，22：429-431.陈绪军，萧明第.干细胞分化为心肌细胞的研究进展.国外医学生理病理与临床分册，2002，22：429-431.8 Gepstein L. Derivation and potential applications of human embryonic stem cells.Circ Res,2002 ，91:866-876.9Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, et al. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart.Circulation, 2002，105: 93-98.我正在做冰冻组织切片的免疫荧光双染。