偶联微球的固化
喷膜：将偶联后微球稀释，用喷膜仪固化在样品垫上，烘干
适用于干式检测，样本质检检测或直接检测。 优点：操作简单，时间短，成本低，微球用量低。缺点：对配方要求高
冻干：微球用稀释液稀释后，冻干机冻干
微球用稀释液稀释后用冻干机冻干 优点：保存周期长，均一性好。缺点：成本高，生产周期长，冻干机需要专业人员操作，检测操作多一步。
缓冲液的离子浓度，缓冲液类型，PH值根据不同厂家的微 球，不同抗体来筛选。EDC和NHS的用量根据实验结果来 筛选。
离心的离心力，离心时间根据微球的粒径来调整，离心力 太小，则离心不完全，损失微球，离心力太大，溶液导致 微球聚集
偶联
抗体，抗原标记浓度，偶联PH值，偶联时间，偶联 温度
封闭
封闭剂：BSA，酪蛋白，乙醇胺，Tris，脱 脂奶粉
时间分辨荧光微球在免疫层析领域的介绍和应用
20180227
时间分辨荧光微球的介绍
¡ 时间分辨荧光免疫分析法是目前与化学发光、电化学发光并驾齐驱的三种超敏免疫分析方法 之一。其原理是采用较长荧光半衰期的稀土离子作标记物，由于这种标记物Stokes位移大(＞ 150nm)且荧光寿命比本底物质荧光寿命高5～6个数量级，因此，测定时只要延缓测量时间， 待本底物质的荧光充分衰减后再测定标记物的信号就可有效地消除各种非特异性荧光的干扰， 获得很高的灵敏度。
的 保 存
记 环 境 是
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检 测 过 程 中 的 问 题
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进口
安捷伦
JSR
南京微 测
国产
苏州为 度
光常 微用 球时
间 分 辨 荧
液体保存：微球直接稀释
微球直接稀释保存在离心管中 优点：直接稀释，操作简单。缺点：难以保存，稳定差。
抽干：抽干机抽干
将微球抽干在枪头，离心管，样品杯，或枪头中。 优点：操作简单。缺点：不适合大量批量操作，对配方要求高。检测操作多一步。
微球聚 集
• 偶联，活化PH值影响，会在活化之后表现出来 • 活化过度，影响微球电荷平衡，会在活化之后表现出来 • 离心过度，复溶后表现出来
微球不 能完全
释放
• 微球稀释液配方 • 样品垫的筛选和处理 • 样品稀释液的筛选
检测过 程中微 球聚集
• NC膜孔径的选择 • 样品稀释液的选择 • 样品垫的选择 • 样本中某些物质的影响
检 测 过 程 中 的 问 题
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因 3 均 2 均果 1 均 3 响 2 范 1 灵 的 3 2 1 测效
¡ 时间分辨荧光微球(Time Resolved Fluorescent Microsphere)作为一种特殊的功能微球， 每个微球中可包裹成千上万个荧光分子，大大提高了荧光的标记效率，有效提高了分析灵敏度； 同时荧光微球表面修饰有合适密度的羧基或其它功能基团，用于与蛋白或抗体的共价偶联，提 高了标记物的稳定性。更为重要的是由于微球包埋的稀土离子已经过了螯合，无需解离增强步 骤，因此从根本上解决了传统的DELFIA法只能在液相中而不能在固相界面反应的问题，从而解 决了将时间分辨荧光应用于免疫层析平台的技术瓶颈，在此基础上可开发出灵敏度高于普通胶 体金或有色乳胶免疫层析方法1-3个数量级的定量检测技术。同样时间分辨荧光微球也可以用 于微孔板超敏定量检测技术平台，只需洗涤几次后即可进行荧光测定，操作步骤比DELFIA简单 很多，更容易实现自动化操作。
时间分辨荧光微球
u 极宽的stoke位移：可消除基质的干扰，提升准确性； u 极长的荧光猝灭时间：可降低背景信号，提升灵敏度；
时间分辨荧光微球常用类型
¡ 粒径：50nm~400nm ¡ 基团类型：羧基，氨基，醛基 ¡ 微球修饰：原子手臂，亲和素
微球偶联抗体或抗原
活化 离心
MES，PBS，硼酸缓冲液稀释微球；EDC，NHS活化；
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品 性膜 性球球 性 膜
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