植物细胞色素P450酶系的研究进展及其与外来物质的关系Ξ刘　宛　李培军　周启星　许华夏　孙铁珩　张春桂(中国科学院沈阳应用生态研究所痕量物质生态过程开放实验室,沈阳110015)摘　要　植物细胞色素P450是分子量为40—60K D 、结构类似的一类血红素2硫铁蛋白。

它以可溶性和膜结合两种形态存在于植物细胞内,可催化多种化学反应,在防御植物免受有害物质侵害方面具有重要作用。

目前已克隆90多个植物细胞色素P450基因。

本文概述了植物P450基因表达调控与环境、发育、组织特异性关系的研究进展。

认为植物P450同工酶在环境毒物生物修复和在抗外源毒素的转基因植物方面具有很高的应用前景。

关键词　植物　细胞色素P450　基因克隆　外来物质The research progress of plant cytochrome P450enzymes and their relationship with xenobioticsLiu wan Li Peijun Zhou Qixing Xu Huaxia Sun Tieheng Zhang Chungui(Laboratory of Ecological Process of Trace Substances in Terrestrial Ecosystems ,Institute of Applied Ecology ,Chinese Academy of Sciences ,Shenyang 110016)Abstract Plant cytochromes P450enzymes are a diverse array of heme 2thiolate proteins with similar structure in the range of molecular weight 40to 60KD.They are found in vari 2ous subcellular locations in soluble and membrane 2bound forms and play an important role in preventing the plants from injury of harmful substances by catalyzing many kinds of reaction.At present ,more than 90genes for cytochromes P450in plants are cloned.The research progress of expression of plant P450gene family is discussed in relation to regulation in re 2sponse to environmental and developmental cues and tissue location.It is thought that the application prospectives for the bioremediation of environmental toxicants by plant P450isozymes and for expressing these P450s in transgenic plants with anti 2exotoxicants are high.K ey w ords plant ;cytochrome P450;gene clone ;xenobiotics 随着科学技术的进步和工业的发展,有机化学品的生产量不断增加。

这些与环境相关的外来化学制剂,统称为异生物质或外来物质(xenobiotics ),常可分为以下几类:多环芳烃、多氯联苯、有机氯、杂环化合物等[1]。

我国该类化合物污染日益严重,在沈阳等大城市及其周围地区的土壤、地面水及地下水中均有较高浓度,这一问题应受到重视[2]。

当前,国内从植物细胞色素(cy 2tochrome )P (pigment )450(简称P450,CYP )酶系角度系统研究上述外来物质生物修复的文献很少[3]。

P450是一类以还原态与CO 结合后在波长450nm 处有吸收峰的含血红素的单链Ξ中国科学院知识创新工程项目(KZCX22401);国家自然科学基金(29877028)资助项目第2卷第5期环境污染治理技术与设备Vol .2,No .52001年10月Techniques and Equipment for Environmental Pollution ControlOct .,2001蛋白质[4]。

因为P450酶系在生物体中具有重要的功能———对许多内源性和外源性的化学物质尤其是对环境有害化学物质存在氧化代谢作用,而受到广泛的重视[4]。

近年来,每年发表的有关P450的研究论文已超过2000篇,也是近年来国际学术界的研究焦点之一[5—7]。

本文就植物P450的研究现状及其与外来物质的关系作简要的综述。

1　植物P 450的发现及组分P450酶系的研究已有40多年的历史。

自1958年首次报道大鼠肝微粒体上存在P450之后,1969年Frear D.S.等人[8]首次报道了植物(棉花)中也存在P450。

大量关于植物P450的研究报道相继出现,在小麦[9]、蓖麻[10]等许多植物中均发现P450。

高等植物由于细胞壁不易破碎,酚类物质、色素物质(叶绿素、类胡萝卜素)等干扰物质含量高,蛋白水解酶、脂肪酶、过氧化物酶等水解酶活性高,以及P450含量低和不稳定等特点,再加上缺乏医学研究的刺激作用,致使植物P450研究进展极为缓慢,远远落后于动物及微生物[11]。

近年来,随着分子生物学方法和技术的日臻改进,以及科学家的不断努力,以小麦、大豆和薯类为模式植物的研究已向纵深发展,研究内容已深入到基因表达、调控水平[12]。

P450单加氧酶是一个多酶复合体,由原卟啉Ⅸ(protoporphyrin )和底物特异的脱辅基蛋白(apoprotein )组成,血红素的结合是通过碳(C )末端的半胱氨酸来完成的。

具体地说,它是由P450、还原性辅酶Ⅱ(NADPH )2P450还原酶、细胞色素b 5、还原性辅酶Ⅰ(NADH )2细胞色素b 5还原酶和磷脂成分组成[3,4,11]。

后者提供了疏水环境和热稳定结构。

植物P450均含有上述组分,但其细胞色素b 5含量远远高于P450,而且前者是一个b 型细胞色素复合体[11]。

植物P450是分子量约为55KD (40—60KD )、结构类似的一族血红素2硫铁蛋白(heme 2thiolate protein ),其活性需要分子态氧、NADPH 和NADPH 2P450还原酶[11,13]。

催化的总反应为:RH +NADPH +H ++O 2 ROH+NADP ++H 2O其中RH 是底物,ROH 是氧化产物。

在植物多功能氧化酶反应中,P450起末端氧化酶的作用,它不仅负责与氧分子结合,活化氧,而且有底物结合位点,故决定酶的专一性;还原型P450可与CO 竞争性结合而成为六配体,活性降低,其最大吸收由λ420nm 转入λ450nm ,而λ450nm 的光照可逆转CO 的抑制作用[3,13]。

当植物P450酶长期暴露于O 2或高温或(和)用去污剂(如胆酸钠、Triton 2X 2114)增溶而转化为无活性状态的P420时,微粒体氧化酶的活性大致成比例地减少。

所以,P420实际是一种失活的P450[11,13]。

研究表明,绿豆微粒体组分中,P420含量远远大于P450,两者之比高达6∶1。

活体测定结果与上述比例相似[14]。

P450具有底物诱导光谱和CO 结合光谱。

按照植物P450酶系的底物诱导光谱的特点将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型[15]。

Ⅰ型P450酶与底物结合在λ420nm 有最小吸收,在λ390nm 有最大吸收,底物的结合会导致蓝移;Ⅰ型结合光谱首先在以色列菊芋[15]和土豆[16]微粒体制备液中观察到,其光谱变化原因是由于底物结合于血红蛋白,从而导致其第6配基的消失,其结果是血红蛋白的自旋状态从低旋转化为高旋状态。

Ⅱ型P450酶与底物的结合在λ430nm 有最大吸收,在λ400nm 有最小吸收,底物的结2 环境污染治理技术与设备 2卷　合会导致红移;Ⅱ型结合光谱已在以色列菊芋[15]和花椰菜[17]微粒体中观察到,苯胺和各种咪唑类化合物均可结合于血红蛋白第6配基的相应位置,但仍保持其低旋状态的特性[11]。

Ⅲ型P450与底物结合的复合体在λ420nm有最大吸收,在λ390nm有最小吸收,即与Ⅰ型P450酶恰好相反。

Ⅲ型光谱变化的原因目前仍不十分清楚,可能是P450血红蛋白处于由高旋向低旋的过渡状态[15]。

NADPH2P450还原酶也是植物多功能氧化酶的一个重要组分,这已从以色列菊芋P450酶系的重组试验中得到直接证明[4,11]。

这是一个黄素蛋白,也位于滑面内质网膜上。

从免疫抗体的研究中也表明,来源于不同组织的NADPH2P450还原酶的抗体可完全抑制以色列菊芋微粒体肉桂酸羧化酶(C4H)活性及其他植物P450单加氧酶活性。

其分子量约为78—82KD,每一分子含有二分子的黄素腺嘌呤二核苷酸,低于此分子量范围的蛋白认为是被部分分解的产物[4,11]。

后者仍能够还原外源的细胞色素C,但不再具有还原P450的能力。

目前认为NADPH2P450还原酶在P450酶系中主要起电子传递体的作用,从NADPH将一个或二个电子传递给P450。

有试验表明,它也是电子从NADH流向P450传递链中的基本组分[4,11]。

NADPH2P450还原酶虽然在植物P450酶系中起重要作用,但尚未有它单独影响氧化代谢作用的报道。

2　植物P450的多样性2.1　植物P450底物的多样性P450酶系可能是自然界中最具催化作用的生物催化剂,其催化的底物范围很广,如多环芳烃(PAHs)、多氯联苯、有机氯等环境毒物、药物、有机染料、植物次生物质等。

这些物质的化学结构可以是极性的,也可能是非极性的[7]。

人类制造的20多万种环境化合物质可能都是P450的底物,其中许多可能是P450不同同工酶的诱导剂或抑制剂。

有些P450对底物有高度选择性,而其他P450具有重叠的底物专一性。

植物P450均具有上述特性,而且其催化的底物范围可能比动物宽得多[11,13]。

2.2　植物P450功能的多样性总体来讲,P450可以催化成千上万的反应,甚至对具有相似化学结构的底物也表现出多种反应类型。

P450在这些氧化代谢中普遍需要分子氧和NADPH,其共同特点是在作用物分子中加入一个氧原子,因此被称为单加氧酶系或羟化酶或复合功能氧化酶(mixed2function oxidase,简称MFO)[4]。