植物细胞培养产酶的研究进展王鑫（吉林师范大学生命科学学院四平136000）指导教师: 杨丽萍摘要：随着植物细胞培养技术的迅速发展，利用植物细胞培养技术生产天然产物的技术也取得了新的进展。

其中，酶是植物细胞培养产生次生代谢产物中的主要产物之一。

本文重点介绍了植物细胞培养产酶的方法和提高酶产量的有效措施，包括植物培养细胞的技术方法、生产过程中的条件控制、提高酶产量的措施、产生酶的种类、以及该技术未来的应用和前景。

关键词：植物；细胞培养；酶Research progress of enzyme production obtained by plant cell cultureWang Xin（College of life science,Jilin Normal University,S iping 136000, China）Instructor: Y ang LipingAbstract:The natural production obtained by using of plant cell culture is progressingsteadily along with the rapid development of plant cell culture technology. We can getmany secondary metabolites by plant cell culture，including enzymes production. Thisarticle focuses on plant cell culture methods to get enzyme production and the effectivemeasures to improve the enzyme production, including the plant cultured cells technologyand methods, the conditions of control in the production process, the measures to improveenzyme production, as well as applications and prospects of the technology in the future.Keywords：plant; cell culture; Enzyme植物细胞培养技术起源于本世纪初，从80年代起就迅速发展起来，并且拥有非常广阔的前景。

目前，植物细胞培养主要有两种类型，包括单倍体细胞培养，原生质体培养[1]。

植物细胞培养具有很多优越性，它不受环境，以及气候条件的限制，节约了生产空间，增值速度也要比整体植株栽培快很多[2]。

植物细胞培养技术主要应用在三个领域，其中就包括有用物质的生产，因为在植物细胞生长过程中会产生丰富的代谢产物。

早在1956年，Routier和Nickell就提出了利用工业化手段培养植物细胞，从而提取天然植物产物的设想[13]。

自此后植物细胞培养技术就迅速发展起来，并且成为了生物工程研发领域的新热点。

目前已经取得了很大的研究进展，也呈现出了更加美好的应用前景。

迄今发现的植物细胞天然代谢产物已有20000种左右，而且还在以每年新发现1600种的速度增涨。

其中包括糖类、酚类、脂类、蛋白质等，这些物质可以作为医药，化妆品，食品，以及农用化学等领域的原料物质。

而这些物质又往往是其他工业手段难以合成的。

其中植物细胞培养产生的酶就广泛应用于医药领域。

那么为了通过植物细胞培养技术产酶，提高酶的产量，选择优良的植物细胞品种，保证合适的培养环境和条件就成为了植物细胞培养产酶实现工业化，并且继续创造广阔前景的先决条件。

1植物细胞培养的技术方法酶是植物细胞培养过程中产生的一种大分子次生代谢产物。

植物细胞培养过程中，细胞生长发育到一定的阶段，新陈代谢产生的大分子化合物。

据报道，目前人们已经研究过的植物细胞培养达200多种，发现的代谢产物也有400多种，产生的酶有10多种，包括：糖苷酶、β-半乳糖苷酶、漆酶、过氧化酶、β-葡萄糖苷酶、酸性转化酶、碱性转化酶、糖化酶、苯丙氨酸裂合酶、木瓜蛋白酶、超氧化物歧化酶、菠萝蛋白酶、剑麻蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、辅酶Q。

根据植物种类，各个部位细胞的特性，培养环境条件，培养技术，产物种类以及产量等这些条件的不同，可以采用很多不同的技术培养植物细胞。

其中包括：固定化培养技术、两相培养技术、反义技术、冠瘿培养技术、毛状根培养技术、添加诱导子或引导物技术、植物细胞悬浮培养生物反应器技术[6]。

本文简单介绍常用的固定化培养技术。

1.1固定化培养技术固定化的概念最早是在酶工程领域提出来的[25]。

固定化培养[10]是将植物细胞用琼脂糖或凝胶等包裹进行培养生产次生代谢产物的技术。

生产实践中可以根据固定方式和培养基质的不同，将固定方法可分成四种：包埋法、吸附法、表面固定法、自身固定法。

利用固定化培养技术培养植物细胞生产代谢产物具有很多优点：首先，固定化培养的细胞可以连续使用，从而可以连续生产，降低生产成本。

其次，植物细胞固定后，可以促进产物的合成从而提高产物的产量。

另外，当放大到反应器规模时可以减少某些因素对细胞生长以及产物合成的影响，同时也使产物的分离变得简单化。

吕华等[25]人发现硬紫草细胞固定化培养时细胞中的产物含量比悬浮细胞培养高。

悬浮细胞培养中的细胞在40天的时候基本解体，不在产生代谢产物，而固定化培养的硬紫草细胞却能够在80天的时间内还能够产生色素。

不仅有效提高了生产效率，还大大降低了生产成本，也为利用植物细胞培养生产次生药用产物的研究提供了新的研究方向。

2植物细胞培养产酶的条件控制2.1高表达细胞系的选择为了有效提高植物细胞次生代谢产物的产量和质量，通常选用高产并且稳定的转基因细胞系。

利用转基因技术，在植物细胞培养过程中具有使用安全，投资小，成本低，易于储藏，方便生产，并且利于遗传操作等一系列优点。

通常可以利用土壤农杆菌介导转化法，基因枪转化法等。

控制细胞系的生理性状，进行筛选，是植物细胞培养技术中新的突破。

例如，中国林科院曾经对红豆杉的愈伤组织进行悬浮磁头的研究，从而获得了高产的细胞系，每升的细胞培养生产天然产物紫杉醇的量可以达到0.25 mg[27]。

通常情况下，致密的，密集的植物组织细胞培养物可以积累更多次生代谢产物。

2.2培养基的选择植物细胞培养的培养基中除了要加入细胞生长必须的碳源和氮源以外，培养基中还应该加入细胞生长代谢所需要的无机盐，满足细胞所需的大量元素，微量元素，如N、P、Mn、B等。

同时还需要多种维生素和植物激素，如分裂素。

几种常见的植物细胞培养基有：MS培养基、B5培养基、White培养基、KM-8P培养基 [4]。

其中MS培养基的特点是培养基的浓度比较高，溶液的性质比较稳定，可以保持离子平衡状态。

B5培养基是Gamborg等[4]人在培养大豆细胞的实验时，专门设计的，它具有铵浓度低，适合木本植物和双子叶植物细胞培养的种种优点。

其中White培养基的无机盐浓度比较低，适于植物细胞的生根培养。

相比于他几种培养基KM-8P培养基最大的优点就是无机成分比较全面。

2.3培养细胞的接种量考虑到细胞的生长和产物的积累，细胞的接种量也需要具有一定的科学根据。

在某种植物细胞培养中，植物细胞的接种量，往往和细胞的增长量成正比，但是如果超过一定的限度，反而会抑制天然产物的产量。

例如，培养紫草[10]细胞，当植物细胞的接种量达到6 g / L的干重时，紫草素的产率为11% , 当接种率达最大值, 并且大于6 g/ L 时,将会抑制紫草素的生产，含量将会急剧下降[19]。

另外也可以通过控制氮源来调整和控制愈伤组织生长，例如，陈永勤[17]就曾经报导氮源的组成影响云南红豆杉生长和产物紫杉醇的含量。

如果培养基中NO3-的浓度高，那么这样将会有利于植物愈伤组织的生长。

然而NH4+ 的浓度高将会抑制愈伤组织的生长，但是反而很明显的提高了紫杉醇的含量。

除了氮源，其他无机盐离子也是细胞生长和产物产率的重要影响因素。

陈浩等[18]人就研究过培养基中氮源以及K+，Mg2+,Ca2+ , SO42- 和PO43- 对茶的愈伤组织生长以及儿茶素含量的影响时发现, 全部是硝态氮对愈伤组织产生儿茶素最为有利；当培养基中氮的总质量浓度为15 mmol/ L 时，愈伤组织的生长量将达到最高；那么如果提高培养基中氮的浓度那么将导致产生儿茶素的量急剧下降。

如果向培养基中添加钾离子可以促进愈伤组织生长但却抑制了儿茶素的产量；通过实验表明1 mmol/L Ca2+ 最利于植物细胞产生儿茶素。

另外 PO43- 对愈伤组织的生长影响也会比较大, 而SO42- 对儿茶素形成影响较大。

因此，要使接种细胞的数量恰到好处，就应该合理配置培养基中各种元素的组分，使细胞生长与代谢产物的产率保持协调。

2.4 PH的控制与调节植物细胞的正常生长发育以及发酵产酶与PH的调节与控制也有着密切的关系，所以在细胞培养过程中一定要严格控制PH的变化。

通常，细胞发酵产生酶的最适PH接近于该酶反应的最适PH.例如，在植物细胞培养过程中PH通常为微酸性，即PH5~6，培养基的酸碱性应控制在5.5~5.8的范围内。

盛长忠等[20]人研究表明，PH的变化会对南方红豆杉( Tax uschinensis )愈伤组织的生长以及紫杉醇的产量有很大的影响。

另外培养基的PH值会随着植物细胞生长繁殖并且长生产物的过程中产生一定的变化，这种变化与细胞的特性和培养基的组成密切相关，所以在培养过程中必须通过改变培养基的组分，使用缓冲液等方法适当的控制和调整培养基的PH.例如，含糖量较高的培养基中，通过糖的代谢产生有机酸，会降低培养基的PH，从而破坏细胞生长的最适宜环境。

另外，在含有尿素的培养基中，尿素会随着水解生成氨，从而使PH 升高，然而随着氨的同化PH又会下降；硝酸盐可以在培养基中充当缓冲剂的角色。

2.5温度的控制与调节与PH值一样，不同植物细胞的生长所需的最适温度也不同，但是植物细胞产酶的最适温度又与其生长的最适温度不同，通常情况下低于其生长的最适温度。

那么为了延长植物细胞产酶的时间，提高酶的稳定性，应该在细胞发酵产酶时将温度控制调节得较低。

例如，植物细胞培养的最适温度通常为25摄氏度左右，通常温度略高时会有利于植物细胞的生长，略低则有利于代谢产物的积累。

但是并不是将温度控制的越低越好。

如果温度过低，反而会使生化反应变慢，从而降低酶的产量，延长培养或发酵周期。

所以，生长和发酵的最适温度都需要通过实验来确定，不能妄加判断，一般应该控制在20~35 摄氏度左右。