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PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚 合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐 热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随 后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
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Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十 余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸 年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
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生物样品
• PCR的特点
第2轮结束
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模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
• PCR反应条件
• 第PC3R轮过程扩增
• PCR的特点
PCR的基本原理
第4轮扩增第5轮扩增
第6轮扩增
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提纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用
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实时荧光定量PCR定义
DNA 5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
GGAUC引G 物酶5‘
合成引物
RNA引物
RNA引物
5引‘A物UC酶GCG
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
PCR技术的原理及应用
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶
5’
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA片段
断基 疗基 品基 测法究人 因 因 因 医类 诊 治 工 学学 程 检研 产
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……
段扩 增 特 定
片
DNA
基因组DNA 获取特定DNA片段
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DNA聚合酶
引物
引物
引物 DNA聚合酶
Sanger的 测序技术
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M13噬菌体
Mullis 的构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
（℃）
55
22
形 成
DNA 2
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
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PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件9550℃
• PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2
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PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件5702℃
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实时荧光定量PCR 原理
如何对起始模板定量？
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
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实时荧光定量PCR 原理 -------- 扩增曲线
荧光基团
荧光检测元件
扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集
55
22
形 成
DNA 2
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
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PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件95℃
• PCR的特点
1 2 模板D3NA
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
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实时荧光定量PCR 原理
常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。
无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检 测。
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实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中 每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲 线的分析对起始模板进行定量分析。
3’
5’
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1971 年 ， Khorana 提 出 ： 经 过 DNA 变 性 ， 与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引 物，并不断重复该过程便可克隆tRNA 基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及 70年代基因工程技术的发明使克隆基 因成为可能，所以，Khorana的设想被 人们遗忘了……
DNA 5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
3’TAGCGCTATCGCATCGACGCT
DNA GGAUCG
聚合酶
5‘
合成引物
5‘AUCGCG A聚DT合NAA酶GCGTAGCTGCGAGGATCG
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
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94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
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94℃
55℃
37℃
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Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 60 性 40
20
(%)
40 50 60 70 80 90
100
温度. (℃)
94℃
55℃
72℃
PCCR过程 • PCR的特点
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物
引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u
1.5mmol/L
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PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
• PCR的特点
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
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PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件7925℃
• PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
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PCR的基本原理 • Taq•
PPCCRR反过应程条件957502℃
• PCR的特点
Taq
Taq
Taq
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PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件72℃